MODERN GENETICS

Предисловие редактора перевода

Одна из характернейших черт современной науки - все углубляющаяся дифференциация и специализация знаний. Этот процесс достиг такого предела, за которым уже ощущается реальная угроза утраты взаимопонимания даже между представителями одной и той же научной дисциплины. Это в полной мере относится и к современной генетике. Представив ее в виде древа, уходящего корнями в известные закономерности, открытые в свое время Грегором Менделем и изложенные им на нескольких журнальных страницах, мы видим сегодня на этом древе десятки больших и малых ветвей, многие из которых выросли буквально на наших глазах и каждая из которых достойна монографического описания на своем собственном, неповторимом языке.

Между тем по самой своей сути и в силу лежащей в ее основе исторической традиции, наука должна быть единой, только в таком случае она способна адекватно отображать объективный мир и приносить максимальную практическую пользу. Именно это обстоятельство определяет возросшую как никогда ранее необходимость создания таких учебников и учебных пособий, в которых непомерно разросшийся и усложнившийся материал был бы упорядочен в стройную систему, доступную целостному восприятию. Понятно, сделать это нелегко, в связи с чем среди многих учебников по генетике, опубликованных за последние годы, почти нет удовлетворяющих требованиям времени. Редкое исключение - «Современная генетика» Ф. Айалы и Дж. Кайгера, предлагаемая вниманию читателей издательством «Мир». Эта книга уникальна. Будучи всеобъемлющей по охвату учебного материала, она вместе с тем отличается высокой органичностью и целостностью его изложения с учетом результатов новейших открытий и разработок. Язык книги ясен и лаконичен.

Поскольку «Предисловие» авторов достаточно полно раскрывает их замысел, а также структуру и особенности книги, какие-либо иные комментарии здесь излишни. Хочу лишь заметить, что успех «Современной генетики», опубликованной вторым изданием спустя всего четыре года после выхода первого, далеко не случаен. Авторы, как известно, преподают генетику в Калифорнийском университете (США), что дает им большое преимущество перед теми, кто пишет учебники, не имея опыта длительной работы и постоянного общения со студентами.

Кроме того, один из авторов книги хорошо известен в генетических кругах как ученый, внесший большой вклад в развитие популяционной и эволюционной генетики. Осмелюсь сделать следующее предположение: известное высказывание выдающегося генетика Ф. Г. Добржанского «...в биологии все обретает смысл лишь в свете эволюционного учения» в значительной мере реализовалось в структуре учебника и в способе подачи материала. Эволюционный и популяционный подходы, действительно позволяющие интегрировать знания о самых разнообразных генетических явлениях и процессах, представлены в «Современной генетике», как ни в каком другом аналогичном издании.

Мне думается, что публикация этой книги на русском языке встретит положительный отклик у студентов, преподавателей и научных работников, поскольку за последние 10-15 лет у нас не издавалось своих учебников такого уровня, как «Современная генетика». С чем это связано, - сказать непросто, однако, по-видимому, нельзя не признать: возрождение отечественной генетики, столь быстро набравшее силу в 60-70-е годы, в последнее десятилетие, к сожалению, сменилось определенным застоем. Однако так долго продолжаться не может. Генетика - подлинный фундамент биологии, и без ее гармоничного и быстрого развития мы не сможем решить те сложные и ответственные задачи, которые выдвигаются перед современной наукой самой жизнью. Наследственность человека и экология, философия, социология и психология, медицина, селекция и биотехнология, - вот далеко не полный перечень тех фундаментальных и прикладных направлений, успешная разработка которых возможна лишь во всеоружии современных генетических знаний.

В заключение хотелось бы сделать одно критическое замечание. Как увидит читатель, в списках литературы, рекомендуемой авторами в конце каждой главы, практически отсутствуют работы советских генетиков. Это весьма досадно, так как Ф: Айала является учеником Ф. Г. Добржанского, во многом способствовавшего укорененю в США традиций советской эволюционно-генетической школы, созданной С. С. Четвериковым.

В настоящем издании книга выходит в трех томах, соответствующих частям оригинальной книги.

Ю. П. Алтухов

Нашим учителям

Предисловие

Генетика - наука быстро развивающаяся. Этими словами начиналось предисловие к первому изданию «Современной генетики».

Справедливость этих слов, а также ценные замечания многих преподавателей, пользующихся первым изданием нашей книги, потребовали значительных дополнений и уточнений всего лишь через четыре года после ее появления.

«Современная генетика» может служить основным учебником при преподавании общей генетики. Предполагается, что студенты уже прослушали курсы общей биологии и химии. Тем не менее, некоторые важные темы (например, митоз и мейоз), с которыми студенты уже должны быть знакомы по этим курсам, излагаются в нашем учебнике заново. Мы умышленно включили в текст больше материала, чем можно пройти за один семестр. Книга написана таким образом, что позволяет преподавателям выбирать материал по своему усмотрению.

Молекулярные основы наследственности остаются основной темой современной генетики и в этом исправленном и дополненном издании. Бурное развитие метода рекомбинантных ДНК за последние четыре года открывает в понимании молекулярных основ генетики человека и других высших организмов такие широкие перспективы, о которых раньше можно было только догадываться. Характерной особенностью «Современной генетики» остается также углубленное изложение популяционной и эволюционной генетики.

Как и в первом издании, при написании книги мы основывались на «комплементарности» областей нашей компетенции. Ф. Айала написал полностью или в основном первый вариант глав 1-3, 10, 18, 19, 21-26 и приложение I; Дж. Кайгер написал начерно главы 4-9 и 11-17. Глава 20 писалась совместно. Последовательность наших фамилий на обложке мы определяли, бросая монету.

Структура книги

Организация материала в этом издании осталась той же, что и в первом, хотя некоторые вопросы изложены по-другому, и добавлены совершенно новые главы, посвященные методу рекомбинантных ДНК, регуляции действия генов эукариот и генетике соматических клеток. «Современная генетика» состоит из трех частей: часть первая - «Организация и передача генетического материала», часть вторая - «Экспрессия генетического материала» и часть третья - «Эволюция генетического материала». Мы уверены, что такая последовательность изложения одновременно и логична, и удобна для преподавания. Она способствует пониманию студентами того, почему излагаются те или иные вопросы и какое место они занимают в процессе наследования в целом. Однако при этом текст предоставляет преподавателю максимальную свободу при составлении конкретной программы курса. Даже если последовательность, в которой излагается материал отдельных глав существенно изменить, это не приведет к появлению серьезных пробелов в знаниях. Мы, однако, считаем, что каждая глава сама по себе составляет логически единое целое и внутри отдельных глав материал лучше всего преподавать в той последовательности, в какой он изложен в книге.

Некоторые изменения в организации и изложении материала по сравнению с первым изданием начинаются уже в первой части. Раздел о составлении хромосомных карт у эукариот (глава 5) был переписан и расширен в соответствии с замечаниями преподавателей и наших собственных студентов. Новая глава 6 посвящена комплементационному анализу и изучению тонкой структуры гена как у прокариот, так и у эукариот. Глава, в первом издании шедшая под номером девять, (Репликация, репарация и рекомбинация ДНК) превратилась в главы 13 и 14, перенесенные во вторую часть, поскольку акцент смещен на функционирование генов, обеспечивающих процессы репликации и рекомбинации ДНК. Новая глава 9 «Методы работы с ДНК» завершает первую часть, поскольку вопросы конструирования рекомбинантных ДНК и анализа последовательности нуклеотидов в ДНК, строго говоря, относятся к теме «Организация и передача генетического материала». Главы 6 и 7 были дополнены новыми появившимися в последние годы данными и получили в этом издании номера 7 и 8 соответственно. Значительная часть материала, входившего ранее в главу 8, в этом издании помещена в главы 6 и 14.

Во второй части появилась совершенно новая глава 16, посвященная регуляции экспрессии генов эукариот. Она в основном содержит результаты успешных исследований рекомбинантных ДНК. Материал главы, носившей этот номер, обновлен и составляет главу 17 «Генетический анализ процессов развития». Новая глава 18 «Генетика соматических клеток» включает впечатляющие результаты исследований по картированию генома человека. Главы 11 и 12 обновлены с тем, чтобы отразить наше углубившееся понимание эволюции генетического кода и пот токов информации в клетках; о главах 13 и 14 уже говорилось выше.

В третьей части мы расширили в главе 21 раздел о дупликациях, поскольку расшифровка нуклеотидных последовательностей ДНК углубляет наше понимание роли дупликаций в эволюции, и добавили раздел об эволюции хромосом человека. В главе 22 при обсуждении генной изменчивости описана изменчивость критических белков и нуклеотидной гетерогенности. В главе 25 по-новому изложен вопрос о неравновесии по сцеплению в соответствии с новыми данными, полученными на основе исследования длинных последовательностей ДНК. В главу 26 включены новые разделы о реконструкции филогении на основе анализа последовательностей ДНК, об эволюции генома посредством удлинения, слияния и дупликации генов и об интригующей проблеме горизонтального переноса генов между видами.

Особенности книги

Это издание, как и предыдущее, щедро иллюстрировано с тем, чтобы облегчить усвоение материала.

Освещение различных специальных вопросов выделено в отдельные дополнения. Большую часть дополнений можно пропускать без нарушения понимания основного текста. Они могут служить источником выборочного факультативного материала.

В конце каждой главы приводится список ключевых слов и понятий для того, чтобы облегчить подведение итогов.

Задачи в конце каждой главы составляют неотъемлемую часть книги, некоторые из них содержат дополнительные сведения, которые мы сочли вспомогательными или слишком подробными для того, чтобы включать их в основной текст. В соответствии с пожеланиями многих преподавателей и студентов мы, наряду с трудными задачами, включили в каждую главу легкие. Ответы на задачи с нечетными номерами приведены в приложении 2 в конце книги.

Студенты, еще не слушавшие курса статистики, найдут в приложении 1 описание понятий и методов, необходимых для понимания текста и решения задач.

В завершающих каждую главу списках литературы перечисляются основные источники, содержащие излагаемый в тексте материал; кроме того, ссылки на дополнительную литературу даются в подписях к рисункам и к таблицам.

Больше всего мы обязаны всем тем ученым, чьи блестящие достижения сделали генетику столь увлекательной наукой. Многим из них мы особенно благодарны за щедрость, проявленную в предоставлении нам неопубликованных фотографий, в разрешении репродуцировать иллюстрации и т.д. Отзывы специалистов, прочитавших рукопись первого издания, внушают нам уверенность в том, что материал изложен достаточно полно и разносторонне. Новый материал, вошедший во второе издание, тоже тщательно рецензировался. За недостатки книги, конечно, несем ответственность только мы, однако многочисленные рецензии позволили свести число недостатков к минимуму.

Мы благодарны Кристал Димодика и Кенди Миллер, перепечатавшим рукопись, и Лоррейн Барр, которая помогла вычитать гранки. Ценную помощь в подготовке этого издания оказали также д-р Хелен К. Зальц, Бонн Грегори и Элизабет Харпер. Лизелотт Горман квалифицированно отредактировала рукопись; мы признательны также издательскому редактору Фреду Раабу за его помощь в подготовке первого издания. На наш взгляд, книга очень выиграла благодаря искусству Джорджа Клатта, выполнившего большинство иллюстраций. Мы искренне благодарны сотрудникам издательства Бенджамин-Каммингс, в особенности Джиму Бенке, Джейн Гиллен и Пат Валдо за проделанную ими большую работу. Сотрудничество с издательством - это всегда стимулирующее занятие, в нашем случае оно было также и приятным.

Дэвис, Калифорния Франциско Айала

январь 1984 Джон Кайгер-младший

Первое и второе издание рецензировали:

Joan W. Bennett, Tulane University

Sarane T. Bowen, San Francisco State University

Alice J. Burton, St. Olaf College

M. Campion, University of Keele, United Kingdom

D. J. Cove, University of Leeds, United Kingdom

Rowland H. Davis, University of California, Irvine

Linda K. Dixon, University of Colorado, Denver

Robert Dottin, Johns Hopkins University

James Farmer, Brigham Young University

Irving Finger, Haverford College

A. T. Ganesan, Stanford University

Lawrence T. Grossman, University of Michigan

Gary N. Gussin, University of Iowa

Barbara A. Hamkalo University of California, Irvine

Philip Hartman, Johns Hopkins University

Eugene R. Katz, S. U. N. Y., Stony Brook

Gary Ketner, Johns Hopkins University

Yun-Tzu Kiang, University of New Hampshire

George Lefevre, California State University, Northridge

Joyce B. Maxwell, California State University, Northridge

John R. Merriam, University of California, Los Angeles

Virginia Merriam, Loyola Marymount University

Roger Milkman, University of Iowa

Jeffrey B. Mitton, University of Colorado

William H. Pétri, Boston College

Raymond L. Rodriguez, University of California, Davis

J. A. Roper, University of Sheffield, United Kingdom

Frank A. Ruddle, Yale University

Henry E. Schaffer, North Carolina State University

Steven R. Seavey, Lewis and Clark College

Eli C. Siegel, Tufts University

Franklin W. Stahl, University of Oregon

John Stubbs, San Francisco State University

J. R. Warr, University of York, United Kingdom

Организация и передача генетического материала

I. Введение

Знаменитый генетик Феодосий Добржанский утверждал, что «все в биологии обретает смысл лишь в свете эволюционного учения». Можно сказать еще более определенно: любой факт в биологии становится понятным лишь в свете генетики. Генетика - это сердцевина биологической науки; лишь в рамках генетики разнообразие жизненных форм и процессов может быть осмыслено как единое целое.

Основы генетики заложены открытиями, которые были сделаны Грегором Менделем в 1866 году, однако оставались почти неизвестными до 1900 года. В первой половине XX века исследователи пришли к выводу, что гены играют основную роль в функционировании и эволюции высших организмов. Однако в полной мере важность этого открытия стала ясна лишь после того, как было установлено, что веществом, ответственным за наследственность у всех организмов, являются нуклеиновые кислоты. Открытие химической структуры ДНК позволило понять молекулярные основы наследственности и механизмы действия генов и их передачи - в форме молекул ДНК из поколения в поколение. Наследственная информация хранится в форме нуклеотидной последовательности ДНК; реализация наследственной информации основана на том, что нуклеотидная последовательность ДНК определяет последовательность аминокислот в белках. Единство всего живого прекрасно демонстрируется тем фактом, что код, связывающий последовательность нуклеотидов в ядре с последовательностью аминокислот, одинаков для всех организмов, будь то бактерии, растения, животные или человек.

На протяжении последних десяти лет генетики разработали методы, которые позволили им в лабораторных условиях воссоздать последовательные этапы эволюции организмов. Более того, эти методы позволяют ставить эксперименты, в природных условиях невозможные. Используя метод рекомбинантных ДНК, генетики научились трансплантировать гены от одних организмов другим, т. е. переносить генетический материал способом, никогда не встречавшимся в эволюции жизни на Земле. Новое знание и возможности использовать его для достижения новых целей имеют глубокие последствия для всей биологии. К «жизни, какой мы ее знаем» в малой, но существенной степени, добавляется «жизнь, которую мы умеем делать».

Цель этой книги -представить генетику таким образом, чтобы, с одной стороны, читатель мог оценить ее место в биологии в целом, а с другой - представить себе путь, которым мы пришли к современному состоянию наших знаний. Вещество наследственности, ДНК, можно рассматривать в трех основных аспектах: структура, функционирование, эволюция. В соответствии с этим книга состоит из трех частей. В первой части описываются природа и организация наследственного материала, а также законы, подчиняясь которым информация, хранящаяся в этом материале, передается из поколения в поколение. Во второй части объясняется, как унаследованная организмом генетическая информация определяет его развитие и функционирование. В третьей части обсуждаются происхождение генетической изменчивости и генетические основы биологической эволюции.

Во введении мы напомним некоторые сведения, которые уже должны быть известны читателю из курса общей биологии. Во-первых, мы вкратце рассмотрим различные типы организмов, а во-вторых, расскажем о митозе и мейозе - двух процессах, посредством которых делятся клетки эукариот.

Вирусы

Мельчайшие частицы, которые могут считаться живыми, - это вирусы. Некоторые из них известны тем, что выступают в качестве возбудителей таких болезней, как грипп, полиомиелит и менингит. Вирусы были открыты в конце XIX века, когда удалось показать, что некоторые болезни (например, мозаичная болезнь табака) могут передаваться размножающимися частицами, столь мелкими, что они проходят сквозь поры фильтров, задерживающих бактерии. Вирусы являются облигатными паразитами животных, растений или микроорганизмов, т. е. они не могут размножаться самостоятельно. Попав в клетку хозяина, они перестраивают ее обмен таким образом, что клетка начинает синтезировать новые необходимые вирусу вещества. И хотя вирусы могут кристаллизоваться и не могут осуществлять собственный метаболизм, их все - таки причисляют к живым организмам, поскольку они способны к размножению.

Вирусы различаются по структуре, форме и размерам (см. рис. 1.1). В 1935 году Венделл Стенли (1904-1971) обнаружил, что в состав вирусов входят нуклеиновые кислоты и белки, т. е. те же соединения, из которых в основном состоят хромосомы высших организмов. Некоторые вирусы (главным образом растительные) содержат рибонуклеиновую кислоту (РНК), остальные (в том числе многие вирусы животных и бактерий) - дезоксирибонуклеиновую кислоту. Вирусы могут иметь форму шара, палочки или состоять из «головы» и «хвоста». Вирусы, вызывающие ящур, - это шарики диаметром около 10нм (1 нм=10^–6мм). Вирус табачной мозаики имеет форму палочки диаметром около 15 нм и длиной 300 нм.

Рис. 1.1. Электронные микрофотографии различных вирусов. Верхний ряд: РНК-вирусы полиомиелита (увеличение х 115 000) ; табачной мозаики ( х 145000) и саркомы Рауса (х 55 000). Средний ряд: ДНК-вирусы папилломы кролика ( х 65 000), оспы (х 40 000) и простого герпеса ( х 140000). Нижний ряд: ДНК-бактериофаги Т4 (х 110000), Т7 ( х 65 000) и лямбда ( х 65 000) (Prof. Robley С. Williams, University of California, Berkely and Prof. Harold W. Eisher, University of Rhode Island)¹.

¹ Здесь и далее в круглых скобках указаны фамилии тех, кто любезно предоставил свои фотографии. - Прим. ред.

Рис. 1.2. Морфология нескольких бактериофа- гов. Видны различия в сложности строения. Многие бактериофаги активно используются в генетических исследо- ваниях.

Рис. 1.3. Жизненный цикл бактериофага. Фаг прикрепляется к клеточной стенке бактерии и вводит в нее свою ДНК, которая перестраивает метаболизм клетки на синтез фаговой ДНК и белков. Далее происходит сборка новых фаговых частиц, которые высвобождаются при лизисе клетки.

Рис. 1.4. Различные типы бактерий. А. Кокки –сферические клетки, одиночные или образующие длинные цепочки. Б. Бациллы - клетки, имеющие форму палочек. В. Спириллы-клетки, имеющие форму спирали. Г. У многих бактерий есть двигательные придатки, называемые жгутиками.

В генетических исследованиях чаще всего используются вирусы бактерий, известные также под названием бактериофаги (дословно «пожиратели бактерий») или просто фаги (рис. 1.2). Фаги прикрепляются к поверхности бактерии и вводят собственную ДНК внутрь клетки, заставляя ее синтезировать компоненты бактериофага. Из этих компонентов собирается множество новых бактериофагов, после чего клетка лизируется и новые фаговые частицы выходят наружу (рис. 1.3).

Прокариоты: бактерии и сине-зеленые водоросли

Простейшие клеточные организмы - это прокариоты (буквально «предъядерные»). К прокариотам относятся бактерии и сине-зеленые водоросли. Диаметр самых мелких бактерий составляет около 0,1 мкм (100 нм), т.е. они меньше наиболее крупных вирусов, однако крупные бактерии, имеющие форму палочки, достигают длины 60 мкм при поперечном диаметре 6 мкм. Бактерии могут иметь сферическую форму, форму палочек или спиралей (рис. 1.4). Клеточная мембрана бактерий окружена прочной клеточной стенкой. Их наследственное вещество заключено в единственной хромосоме, однако ядерной мембраны, отделяющей хромосому от остальной клетки, у бактерий нет (почему они и названы прокариотами). У бактерий нет также митохондрий и некоторых других органелл, характерных для цитоплазмы высших (эукариотических) клеток.

Некоторые бактерии, например Escherichia coli, обитающая в кишечнике человека и других млекопитающих, и Pneumococcus pneumoniae - возбудитель бактериальной пневмонии, активно используются в генетических исследованиях.

У сине-зеленых водорослей, так же как и у бактерий, есть клеточная стенка, однако ядерная мембрана и некоторые цитоплазматические органеллы отсутствуют. В отличие от бактерий сине-зеленые водоросли, как правило, образуют грозди или нити, состоящие из множества клеток.

Бактерии исине-зеленые водоросли обычно размножаются простым делением клетки, которое происходит после дупликации (удвоения) хромосомы.

Одноклеточные и многоклеточные эукариоты

К эукариотам (буквально «обладающие настоящим ядром») относятся все клеточные организмы, кроме бактерий и сине-зеленых водорослей. В эукариотических клетках есть ядерная мембрана, ограничивающая ядро, в котором находятся по крайней мере две хромосомы. В хромосомах эукариот ДНК образует комплексы с определенными белками, которые называются гистонами (см. гл. 4). Кроме того, в эукариотических клетках присутствуют определенные органеллы и структуры, которых нет у прокариот: митохондрии, хлоропласты (только в клетках растений), аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум и вакуоли (рис. 1.5).

Эукариоты могут быть как одноклеточными, так и многоклеточными. Из одноклеточных эукариот наиболее часто в генетических экспериментах используются водоросль Chlamidomonas reinhardi, инфузория Paramecium aurelia, дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Из многоклеточных эукариот объектами генетических исследований часто бывают грибы Neurospora crassa и Aspergillus nidulans, кукуруза (Zea mays), плодовая мушка (Drosophila melanogaster), домовая мышь (Mus musculus) и человек (Homo sapiens).

Рис. 1.5. Схема строения эукариотической клетки (на рисунке -клетки млекопитающего). Хорошо заметная органелла ядра -это ядрышко.

Рис. 1.6. Жизненный цикл организмов, размножающихся половым путем. В результате оплодотворения женской гаметы мужской гаметой образуется зигота. Зигота многократно последовательно митотически делится, давая начало множеству клеток организма. Те клетки, из которых формируются гаметы, называются клетками зародышевой линии. Они также размножаются митотически, но затем претерпевают мейоз, в результате которого число хромосом уменьшается вдвое. При половом размножении диплоидная и гаплоидная (гаметная) фазы обязательно чередуются.

Размножение у эукариот может быть бесполым (вегетативным) или половым. При бесполом размножении единственный родительский организм делится на две или несколько частей, причем из каждой вырастает по новой особи. Бесполое размножение широко распространено у растений: из маленького кусочка растения, отделенного надлежащим образом, при соответствующих условиях может образоваться новое растение. Картофель, например, легче разводить клубнями, чем семенами, а большинство фруктовых деревьев разводят черенками. Бесполое размножение встречается также у грибов и некоторых низших животных, например у плоских червей.

При половом размножении происходит слияние двух половых клеток или гамет; они образуют одну клетку, называемую зиготой, из которой развивается новый организм. Обычно гаметы принадлежат разным родителям. Исключением из этого правила является самооплодотворение, при котором обе гаметы производятся одним родительским организмом.

Таблица 1.1. Диплоидное число хромосом (2N) различных видов животных и растений

Вид	Число хромосом
Человек Homo sapiens	46
Шимпанзе Pan troglodytes	48
Макак-резус Масаса mulatto	48
Лошадь Equus caballus	64
Осел Equus asinus	62
Собака Canis familiaris	78
Кошка Fetts domesticus	38
Домовая мышь Mus muscu/us	40
Крыса Rattus norvégiens	42
Опоссум Didelphys virginiana	22
Курица Gallus domesticus	78
Индейка Meleagris gallopavo	82
Лягушка Rana pipiens	26
Меченосец Platypoecilus maculatus	48
Морская звезда Asterias forbesi	36
Тутовый шелкопряд Bombyx mori	56
Комнатная муха Musca domestica	12
Плодовая мушка Drosophila melanogaster	8
Комар Culex pipiens	6
Таракан Blatta germanica	23♂, 24♀
Рак-отшельник Eupagurus ochotensis	254
Белый дуб Quercus alba	24
Желтая сосна Pinus ponderosa	24
Слива Prunus cerasus	32
Капуста Brassica oleracea	18
Редька Raphanus sativus	18
Горох огородный Pisum sativum	14
Душистый горошек Lathyrus odoratus	14
Фасоль Phaseolus vulgaris	22
Огурец Cucumis sativus	14
Хлопчатник Gossypium hirsutum	52
Картофель Solanum tuberosum	48
Помидоры Solanum lycopersicum	24
Табак Nicotiana tabacum	48
Пшеница мягкая яровая Triticum aestivum	42
Пшеница английская Triticum turgidum	28
Ячмень Hordeum vulgäre	14
Рожь Secale céréale	14
Рис Oryza saliva	24
Львиный зев Antirrhinum majus	16
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae	34
Зеленая водоросль Acetabularia mediterranea	20

Жизненный цикл развития и полового размножения многоклеточных эукариот схематически изображен на рис. 1.6. Число хромосом в клетке, характерное для данного вида, сохраняется постоянным из поколения в поколение, поскольку существуют два типа деления клеток: один для образования соматических клеток (или клеток тела) и другой для образования гамет. Процесс деления соматических клеток называется митозом. При митозе все хромосомы дуплицируются (удваиваются) перед началом деления клетки. В процессе митоза дуплицированные хромосомы распределяются поровну между двумя дочерними клетками. В результате все соматические клетки организма обладают одинаковым числом хромосом. Посредством митоза делятся также одноклеточные эукариоты. Гаметы образуются в процессе мейоза. При мейозе каждая клетка делится дважды, а число хромосом удваивается лишь один раз. Вот почему число хромосом в гаметах вдвое меньше, чем в соматических клетках. Пара гамет (одна мужская половая клетка и одна женская) сливается в процессе, который называется оплодотворением. Образующаяся при этом зигота имеет число хромосом, характерное для соматических клеток организма. Митоз и мейоз более подробно описаны в следующих разделах.

Рис. 1.7. 46 хромосом мужчины. В нижней части фотографии гомологичные хромосомы изображены попарно. Специально используемая методика окраски выявляет поперечную исчерченность, индивидуальную для каждой хромосомы. На этих хромосомах метафазной пластинки можно различить около 400 темных и светлых полос (Prof. W. Roy Breg, Yale University).

Если число хромосом в гамете обозначить буквой N, то число хромосом в зиготе будет равно 2N, по половине от каждой из гамет. Если зигота делится митотически, то в каждой из двух дочерних клеток количество хромосом составит 2N. В процессе развития эти клетки делятся снова и снова, и каждая из клеток многоклеточного организма содержит по 2N хромосом. Организм продуцирует также гаметы, но они возникают в результате мейоза, и каждая из них содержит лишь по N хромосом. Когда две гаметы при оплодотворении сливаются, восстанавливается число 2N, характерное для данного вида организмов и сохраняющееся из поколения в поколение. Число хромосом в клетках различных эукариот может быть весьма различным. У некоторых видов хромосомное число равно двум; у других оно может достигать нескольких сотен (табл. 1.1). Клетки с двойным набором хромосом, т.е. соматические клетки, мы будем называть диплоидными; клетки с одинарным набором хромосом, т.е. гаметы, называются гаплоидными.

В диплоидных организмах две хромосомы одной пары называют гомологичными; хромосомы, не являющиеся членами одной пары, называются негомологичными. У раздельнополых организмов, к которым относится большинство животных, обычно одна из пар хромосом ответственна за определение пола; хромосомы этой пары называются половыми. Все остальные хромосомы носят название аутосом. Две половые хромосомы в отличие от всех других гомологичных хромосом не обязательно одинаковы по размеру и форме. Один из полов (у млекопитающих и многих насекомых это самцы, а у бабочек и птиц-самки) называется гетерогаметным, поскольку у представителей этого пола половые хромосомы (обычно обозначаемые буквами X и Y) резко отличаются друг от друга. Противоположный пол называется гомогаметным, особи этого пола обладают сходными половыми хромосомами (а именно Х-хромосомами). Таким образом, у людей, мышей и дрозофил самцы характеризуются парой половых хромосом XY, а самки-XX (рис. 1.7). У некоторых видов Y-хромосома вовсе отсутствует; гетерогаметный пол в таком случае обозначается символом ХО, тогда как гомогаметный - по-прежнему символом XX.

Митоз

Митозом называется процесс деления ядра клетки, в результате которого из одной клетки образуются две дочерних, причем число хромосом в каждой из них совпадает с числом хромосом в родительской клетке. Хромосомы удваиваются в течение особого периода клеточного цикла, предшествующего митозу. Этот период называется S, по первой букве слова "synthesis", поскольку в течение этого периода происходит синтез ДНК хромосом. S-периоду предшествует период G₁ (от слова "gap"-перерыв), а за ним следует период G₂. В течение периодов G₁ и G₂ рост клеток и метаболизм продолжаются, однако репликации хромосом не происходит. Если мы обозначим митоз буквой М, то последовательность событий на протяжении клеточного цикла может быть представлена в виде G₁®S®G₂®M (рис. 1.9). Затем цикл повторяется снова и снова, пока продолжается процесс деления клеток (пролиферация! и 1.11). О клетках, не участвующих в митозе, говорят, что они находятся в интерфазе; последовательные митозы всегда разделены интерфазным периодом, в течение которого происходит синтез ДНК.

Дополнение 1.1. Хромосомы

Хромосомы представляют собой длинные нитевидные образования, которые во время деления клетки сжимаются, становясь короче и плотнее, так что в каждой можно различить центромеру и одно или два плеча хромосомы. В зависимости от расположения центромеры выделяются три типа хромосом (см. рис. 1.8);

1. Метацентрические, у которых плечи имеют примерно одинаковую длину (т.е. центромера расположена посреди хромосомы).

2. Акроцентрические, у которых длины плеч сильно различаются (т. е. центромера сдвинута к одному из концов хромосомы).

3. Телоцентрические, у которых хорошо заметно лишь одно плечо (т.е. центромера находится на самом конце хромосомы или очень близко от него).

Рис. 1.8. Первая, пятая и тринадцатая хромосомы человека представляют на этом рисунке соответственно метацентрический, акроцентрический и телоцентрический типы хромосом.

Негомологичные хромосомы можно отличить друг от друга по размеру и положению центромеры. Некоторые участки хромосом называются гетерохроматиновыми («окрашенными по-другому»), поскольку они сохраняют плотную компактную структуру в интерфазе и на ранних стадиях профазы клеточного деления. Другие участки хромосом или целые хромосомы называются эухроматиновыми («нормально окрашенными»). Расположение гетерохроматиновых участков учитывают при идентификации хромосом.

Хотя митоз - это процесс, происходящий без резких переключений, однако определенные ключевые события позволяют выделить четыре стадии митоза: профазу, метафазу, анафазу и телофазу (рис. 1.10

Рис. 1.9. Клеточный цикл. Период синтеза ДНК (S) отделен от предшествовавшего и последующего митозов (М) двумя «перерывами», g₁- и G₂-периодами соответственно. Относительная продолжительность S-, М- и G-периодов у различных организмов различна.

Рис. 1.10. Четыре стадии митоза. Дупликация хромосомного материала происходит в интерфазе, предшествующей началу профазы.

Рис. 1.11. Митоз у пиона, Paeonia californica, 2N = 10 (χ 850). (Dr. Marta S. Walters, University of California, Santa Barbara, and the late Prof. Spencer W. Brown, University of California, Berkely.)

Профаза. Эта стадия характеризуется постепенным уплотнением (конденсацией) и спирализацией хромосом, в результате чего они становятся различимы под микроскопом, образуя нитевидные структуры. Видно, что каждая хромосома состоит из двух копий, расположенных вдоль друг друга и соединенных центромерой. Эти копии, пока они не разошлись, называются сестринскими хроматидами. Другим характерным событием профазы является постепенное исчезновение ядрышка, содержимое которого распределяется по всему ядру. У большинства организмов в профазе начинает разрушаться ядерная мембрана.

Метафаза. У большинства организмов в этот период исчезает ядерная мембрана и хромосомы, прикрепленные центромерами к нитям веретена, оказываются в цитоплазме. На этой стадии хромосомы собираются в плоскости, расположенной посередине между полюсами веретена. Образовавшаяся метафазная пластинка представляет собой наиболее характерную особенность метафазы.

Анафаза. Обычно это самая короткая стадия митоза. Каждая центромера делится пополам (при этом хроматиды становятся хромосомами), и две дочерние центромеры устремляются к противоположным полюсам веретена, увлекая за собой по одной из двух дочерних хромосом.

Телофаза. Два набора хромосом группируются у противоположных полюсов веретена. Здесь они начинают раскручиваться и удлиняться, приобретая форму интерфазных хромосом. Вокруг каждого набора хромосом образуется ядерная мембрана, и вновь возникают ядрышки. Клеточное деление (цитокинез) также полностью завершается на этой стадии.

Мейоз

Мейоз – это два последовательных деления ядра, которые приводят к образованию гамет. Во время мейоза каждая клетка делится дважды, в то время как хромосомы удваиваются лишь один раз, в результате чего число хромосом в гамете оказывается вдвое меньше их числа в исходной клетке. Два последовательных деления обозначаются терминами мейоз I и мейоз II. В каждом из этих двух мейотических делений можно выделить четыре стадии: профаза, метафаза, анафаза и телофаза (рис. 1.12 и 1.13). Предшествующая мейозу интерфаза полностью аналогична митотической интерфазе; дупликация хромосом происходит в течение S-периода.

Мейоз I

Профаза I. Это очень сложная стадия, которую обычно подразделяют на пять подстадий: лептотену, зиготену, пахитену, диплотену и диакинез. Для лептотены характерно начало спирализации и уплотнения хромосом; они приобретают нитевидную форму и похожи на хромосомы в начале профазы митоза.

Рис. 1.12. Стадии мейоза. Репликация (удвоение) хромосомного материала происходит в Sпериоде премейотической интерфазы. В первом мейотическом делении происходит уменьшение вдвое числа центромер, однако каждая центромера прикреплена к дуплицированной хромосоме. Во втором делении мейоза происходит деление центромер и превращение каждой дуплицированной хромосомы в пару самостоятельных хромосом.


Лептотена	Зиготена

Пахитена	Диплотена

Диакинез	Метафаза I

Анафаза I	Телофаза I


Интерфаза	Профаза II

Метафаза II	Анафаза II

Телофаза II	Интерфаза
Рис. 1.13. Мейоз у самца кузнечика Chorthippus parallelus, 2N = 17 (у самки 2N = 18) (х 1500). Из четырех образовавшихся ядер (см. последнюю фотографию) два содержат по девять хромосом, а два -по восемь, поскольку в них отсутствует Х-хромосома. (Prof. James L. Walters, University of California, Santa Barbara.)

На стадии зиготены гомологичные хромосомы конъюгируют, т.е. соединяются друг с другом наподобие застежки «молния». Такое соединение гомологичных хромосом называется синопсисом. Это важное генетическое событие, поскольку оно делает возможным обмен участками между гомологичными хромосомами, называемый кроссинговером. Две сцепленные таким образом хромосомы называются бивалентом. Бивалент, таким образом, состоит из четырех хроматид. Стадия пахитены характеризуется укорочением и утолщением бивалентов.

На стадии диплотены две гомологичные хромосомы почти расходятся, однако сестринские хроматиды, остаются соединенными общей центромерой. Кроме того, у гомологичных хромосом остаются одна или несколько зон контакта, которые называются хиазмами. Каждая хроматида может образовывать хиазмы с любой из хроматид гомологичной хромосомы, так что хиазмами могут быть связаны две, три или все четыре хроматиды бивалента, хотя каждая хиазма затрагивает лишь пару хроматид (рис. 1.14). Число хиазм в биваленте может быть различным, но обычно их бывает две-три. Например, в мейозе у человека (у женщин) в среднем можно наблюдать две-три хиазмы на бивалент, хотя число хиазм в длинных хромосомах обычно больше, чем в коротких. Наличие хиазм свидетельствует о том, что между хроматидами происходит кроссинговер (т.е. обмен участками).

Рис. 1.14. Четыре типа хиазм. А. Одиночная хиазма. Б. Две хиазмы, затрагивающие пару хроматид. В. Две хиазмы, связывающие три хроматиды. Г. Две хиазмы, связывающие все четыре хроматиды.

Диакинез характеризуется максимальным утолщением и спирализацией хромосом, принимающих форму коротких толстых палочек. У большинства организмов на этой стадии хиазмы перемещаются в направлении от центромер к концам хромосом и исчезают. В результате к концу диакинеза контакт между хроматидами сохраняется лишь на одном или обоих концах (рис. 1.15). После завершения диакинеза ядерная мембрана и ядрышки растворяются.

Метафаза I. Биваленты прикрепляются центромерами к нитям веретена и собираются в метафазной пластинке, причем центромеры гомологичных хромосом располагаются на противоположных сторонах пластинки. В метафазе I мейоза гомологичные хромосомы связаны друг с другом переместившимися к концам хромосом хиазмами в отличие от метафазы митоза, когда гомологичные хромосомы не образуют пары.

Анафаза I. Центромеры каждой пары гомологичных хромосом расходятся к полюсам веретена, увлекая за собой по паре хроматид каждой хромосомы. Соединенные ранее концы гомологичных хромосом расходятся, и хромосомы все более удаляются друг от друга. Важное отличие от митотической анафазы состоит в том, что в анафазе I мейоза центромеры не делятся.

Телофаза I. После того как перемещение хромосом к полюсам веретена в анафазе завершено, вокруг каждого набора гомологичных хромосом образуется ядерная мембрана, и клетка делится на две дочерние.

Интерфаза между мейозом I и мейозом II обычно проходит быстро или отсутствует вовсе. Ее важное отличие от интерфазы, предшествующей мейозу I или митозу, состоит в том, что синтеза новой ДНК в промежутке между мейозом I и мейозом II не происходит.

Рис. 1.15. Во время диакинеза хиазмы сдвигаются к концам бивалентов.

Мейоз II

К началу мейоза II хромосомы уже дуплицированы, и пары сестринских хроматид соединены общими центромерами. Однако каждая клетка содержит одинарный набор хромосом (N), а не двойной (2N), как в начале митоза или мейоза I. Профаза II часто проходит очень быстро. В метафазе II хромосомы прикрепляются центромерами к нитям веретена и располагаются в метафазной пластинке. К началу анафазы II каждая центромера делится (в первый и единственный раз в течение мейоза), и сестринские хроматиды таким образом становятся хромосомами, расходящимися затем к противоположным полюсам. Телофаза II завершается образованием ядерной мембраны вокруг каждого из двух гаплоидных ядер.

Мейоз I начинается в клетке, содержащей 2N удвоенных (дуплицированных) хромосом, и кончается образованием двух клеток (точнее, двух хромосомных комплексов, поскольку клеточное деление еще не совсем завершено), каждая из которых содержит по N дуплицированных хромосом. Мейоз II заканчивается образованием четырех клеток, каждая из которых содержит по N одинарных хромосом. Клетки, образуемые таким образом в мужских репродуктивных органах животных, носят название сперматозоидов. У самок, однако, лишь одна из четырех образующихся в мейозе клеток является яйцеклеткой ; остальные три клетки представляют собой полярные тельца, не способные выполнять функции гамет (рис. 1.16). У высших растений образующиеся в процессе мейоза мужские и женские половые клетки называются микроспорами и мегаспорами соответственно (рис. 1.17).

Рис. 1.16. Образование гамет у дрозофилы. Клетки зародышевой линии размножаются посредством митозов, а затем претерпевают мейоз и превращаются в ооциты (у самок) и в сперматоциты (у самцов). У самок лишь одна из четырех образующихся при мейозе клеток становится яйцеклеткой. Все четыре клетки, образующиеся в мейозе у самцов, называются сперматидами; в результате последующей дифференцировки они превращаются в сперматозоиды.

Рис. 1.17. Жизненный цикл и образование гамет у растения. У диплоида в результате мейоза происходит образование спор. Диплоидное растение называется спорофитом; гаплоидная фаза, включающая стадию созревания гамет, называется гаметофитом. Гаплоидная фаза может существовать в форме самостоятельного растения, независимого от диплоидной фазы. Например, у мхов гаметофиты представляют собой именно то, что мы называем мхом, тогда как спорофит представляет собой стебелек, живущий «паразитически» на гаметофите.

Значение мейоза

Митоз-это эквационное деление клетки, в результате которого хромосомные наборы дочерних клеток оказываются идентичными хромосомному набору родительской клетки. Иное дело мейоз: первое мейотическое деление является редукционным; второе - эквационным.

Мейоз I называется редукционным делением, поскольку число центромер и хромосом в клетках, образовавшихся в результате этого деления, вдвое меньше их числа в родительской клетке. Из каждой пары гомологичных хромосом родительской клетки одна из дочерних клеток получает отцовскую хромосому, а вторая-материнскую. Отцовская и материнская хромосомы могут содержать различную генетическую информацию; например, в отцовской хромосоме может содержаться информация «глаза карие, группа крови В», а в материнской - «глаза - голубые, группа крови О». Таким образом, клетки, возникшие в результате первого мейотического деления, генетически различны. Эти различия, однако, не всегда относятся к хромосоме в целом; каждый раз, когда несестринские хроматиды обмениваются участками, две хроматиды одной хромосомы становятся генетически различными (см. рис. 1.14).

С другой стороны, мейоз II - это эквационное деление, завершающееся делением центромер. Сестринские хроматиды - а, следовательно, и ядра, возникающие в результате мейоза II, - генетически идентичны (если не считать, как отмечалось в предыдущем абзаце, рекомбинантных участков). Существуют и некоторые другие различия между митозом и мейозом, которые можно видеть на рис. 1.18.

Генетическое значение мейоза можно суммировать следующим образом:

1. Мейоз обеспечивает постоянство числа хромосом у разных поколений организмов, размножающихся половым путем. Половое размножение включает стадию оплодотворения - слияния двух половых клеток или гамет. Если бы число хромосом в половых клетках было бы таким же, как и в соматических, то число хромосом удваивалось бы в каждом поколении.

2. В метафазе I каждая отцовская и материнская хромосома имеет равную вероятность оказаться по ту или другую сторону метафазной пластинки. Соответственно в каждой гамете могут оказаться как отцовские, так и материнские хромосомы. Если число хромосом значительно, то число возможных комбинаций сочетания отцовских и материнских хромосом в гамете очень велико, а вероятность того, что в определенную гамету попадут хромосомы только одного из родителей, очень мала. Рассмотрим, например, кариотип человека. В каждой нормальной клетке содержится 23 пары хромосом. Предположим, что первая отцовская хромосома оказалась по определенную сторону метафазной пластинки. Вероятность того, что по ту же сторону пластинки окажется вторая отцовская хромосома, равна ¹/₂; то же самое справедливо для третьей, четвертой и всех остальных хромосом (рис. 1.19). Вероятность того, что все 23 отцовские хромосомы отойдут к одному полюсу, равна (¹/₂)²² = '/4 194 304, т.е. меньше одной четырехмиллионной.

Рис. 1.18. Сравнение мейоза и митоза. В обоих случаях хромосомы однократно удваиваются, однако в мейозе происходит два клеточных деления, в результате чего число хромосом, приходящихся на одно ядро, уменьшается вдвое. Другое важное различие состоит в том, что в мейозе гомологичные хромосомы попарно объединяются, а в митозе - нет.

Рис. 1.19. Четыре возможных типа взаимного расположения двух пар хромосом в метафазной пластинке. Две хромосомы, направляющиеся вместе к одному и тому же полюсу веретена, расположены в одном пятне; материнские хромосомы выделены более темным цветом, отцовские - более светлым. При одной паре хромосом число вариантов взаимного расположения равно двум; при двух парах - четырем (2²=4), при η парах число вариантов составляет 2ⁿ. Заметим, что число различных вариантов результатов мейоза вдвое меньше числа взаимных расположений: результаты мейоза вариантов 1 и 2 одинаковы; то же относится и к вариантам 3 и 4. Вероятность того, что все отцовские (и соответственно все материнские хромосомы) направятся к одному полюсу веретена, равна (1/2)ⁿ ^{– 1}. Эта вероятность равна 1/2 для двух пар хромосом (п = 2), но быстро уменьшается с ростом числа хромосом.

3. Кроссинговер между несестринскими хроматидами еще больше перемешивает материнские и отцовские наследственные признаки в гаметах. В результате обмена участками между несестринскими хроматидами число различных типов гамет становится практически бесконечно большим. Напомним, что у человека в среднем на каждую хромосому приходится две-три хиазмы, а следовательно, два-три обмена участками хроматид. Границы этих участков от мейоза к мейозу варьируют, так что обмен генетическим материалом происходит каждый раз по-новому.

Литература

Beadle G., Beadle M., 1966. The Language of Life, An Introduction to the Science of Genetics, Doubleday, Garden City, N.Y.

Bracket J., Mirsky A.E., 1961. The Cell, vol. 3, Meiosis and Mitosis, Academic Press, New York.

Cairns J., StentG.S., Watson J.D., eds., 1966. Phage and the Origins of Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

Carlson E., 1966. The Gene: A Critical History, Saunders, Philadelphia.

DunnL.C., 1965. A Short History of Genetics, McGraw-Hill, New York.

Lurid S.E., Gould S.J., Singer S., 1981. A View of Life, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif.

Margulis L. (1974). Five-kingdom classification and the origin and evolution of cells, Evol. Biol., 7, 45-78.

NagleJ.J., 1981. Heredity and Human Affairs, Mosby, St. Louis.

Stubbe H., 1972. History of Genetics, MIT Press, Cambridge, Mass.

Sturtevant A.H., 1965. A History of Genetics, Harper and Row, New York.

Wilson E. O., Eisner T., Briggs W.R., Dickerson R.E., Metzenberg R.L., O'Brien R.D., Susman M., Boggs W.E., 1978. Life on Earth, 2nd éd., Sinauer, Sunderland, Mass.

Wolfe S.L., 1972. Biology of the Cell, Wadsworth, Belmont, Calif.

Ключевые слова и понятия

Акроцентрическая хромосома

Анафаза

Аутосома

Бактериофаг

Веретено

Вирус

Гамета

Гаплоид

Гетерогаметный пол

Гетерохроматин

Гомогаметный пол

Гомологичные хромосомы

Диплоид

Зигота

Интерфаза

Клеточный цикл

Кроссинговер

Мейоз

Мейоз I

Мейоз II

Метафаза

Метацентрическая хромосома

Митоз

Негомологичные хромосомы

Оплодотворение

Половые хромосомы

Прокариоты

Профаза

Синапсис

Соматическая клетка

Телофаза

Телоцентрическая хромосома

Хроматида

Хромосома

Центромера

Эукариоты

Эухроматин

Ядро

Задачи

1.1. Предположим, что мейоза не существует и оплодотворение у размножающихся половым путем организмов происходит в результате слияния двух соматических клеток с нормальным числом хромосом. Сколько хромосом будет у потомков организма с восемью хромосомами в пятом, десятом и сотом поколениях?

1.2. Перечислите общие черты и различия митоза и мейоза.

1.3. Нормальное число хромосом в клетках человека равно 46. Сколько хромосом содержат а) сперматозоиды, б) яйцеклетки, в) полярные тельца?

1.4. Нередко встречаются соматические клетки, число хромосом в которых отличается от числа хромосом в большин-

стве других соматических клеток. У человека, например, некоторые клетки печени содержат по 92 хромосомы. Как возникают такие клетки?

1.5. В потомстве каких организмов следует ожидать большего генетического разнообразия : размножающихся вегетативным или половым путем? Почему?

1.6. Предположим, что клетки некоторого организма содержат по три пары хромосом и каждая хромосома отличается от гомологичной одним морфологическим признаком (например, наличием или отсутствием перетяжки у одного из концов хромосомы). Сколько различных· типов гамет по этому признаку может быть у такого организма?

2.Менделевская генетика

Первые представления о наследственности

Дети похожи на родителей, и хотя это сходство далеко не абсолютно, оно тем не менее явно свидетельствует о существовании биологической наследственности. Люди давно поняли, что половой акт и у человека, и у животных связан с размножением. Следовательно, естественно было предположить, что семя самцов служит носителем наследственности, однако, как именно это происходит, оставалось не ясно. Многие века господствовала теория пангенеза, согласно которой семя образуется во всех частях тела, а затем по кровеносным сосудам попадает через семенники в пенис. Сходство между родителями и потомством объяснялось тем, что семя, образуясь в различных частях тела, отражает характерные особенности каждой из них.

Теория пангенеза была известна уже Аристотелю (384-322 г. до н. э.) и другим древнегреческим философам и преобладала еще в XIX в. Жан Батист де Ламарк (1744-1829) считал пангенез основным механизмом эволюционных изменений. По Ламарку, эволюция была накоплением в чреде многих поколений благоприобретенных признаков: упражнение или неупражнение органов, по его мнению, приводят к таким изменениям в организме (например, развитие мускулатуры у спортсмена), которые могут передаваться потомству. Теория пангенеза принималась и другими великими биологами XIX века, включая Чарлза Дарвина (1809-1882).

Первый серьезный вызов теории пангенеза был брошен Августом Вейсманом (1834-1914), который противопоставил ей теорию зародышевой плазмы. Он провел различие между зародышевой плазмой, включающей половые клетки и клетки, из которых они образуются, и соматоплазмой, к которой отнес клетки остальной части организма. По Вейсману, зародышевая плазма остается неизменной, передаваясь при размножении из поколения в поколение, тогда как соматоплазма преходяща и создается зародышевой плазмой лишь для того, чтобы защитить себя от повреждений и способствовать размножению. Эта точка зрения в корне противоречила теории пангенеза, в соответствии с которой семя слагается из частиц, выделяемых соматоплазмой и отражающих ее свойства. Вейсман подкрепил свою теорию экспериментом, который сегодня нам кажется несколько примитивным, но который, однако, оказал значительное влияние на последующее развитие представлений о наследственности. На протяжении многих поколений он отрезал хвосты мышам и обнаружил, что длина хвоста у их потомков остается неизменной. Из этого он заключил, что наследственные признаки хвоста определяются не частицами, формируемыми в самом хвосте; напротив, они определяются клетками зародышевой плазмы, которая при отрезании хвостов остается неизменной.

Открытие законов наследственности

Основные законы наследственности были открыты Грегором Менделем (1822-1884), монахом августинского монастыря, жившем в австрийском городе Брюнне (ныне Брно, Чехословакия). Примерно с 1856 г. он начал экспериментировать с горохом (Pisum sativum), для того чтобы узнать, как передаются по наследству индивидуальные признаки этого организма. Опыты Менделя и по сегодняшним меркам могут служить прекрасным образцом научного исследования. Результаты экспериментов он опубликовал в Известиях общества естественной истории в Брюнне в 1866 г., но его статья не привлекла никакого внимания ученых.

Законы Менделя были вторично открыты в 1900 году тремя учеными, получившими сходные с Менделем результаты и признавшими его приоритет. Это были Гуго де Фриз из Голландии, Карл Корренс из Германии и Эрих Чермак из Австрии. С этого момента для всех стало очевидным, насколько велико значение работы Менделя: именно им был открыт путь к разгадке тайны наследственности. Многие биологи заинтересовались генетикой. Первоочередной задачей было показать, что принципы Менделя приложимы не только к растениям, но и к животным. Это было сделано в первые же годы XX века в основном Люсьеном Кено во Франции, Вильямом Бэтсоном в Англии и Вильямом Кастлем в США. Вскоре последовали новые важные открытия.

Рис. 2.1. Грегор Мендель - ученый, открывший фундаментальные законы наследственности.

Методы Менделя

До Менделя многие ученые пытались понять, как наследуются биологические признаки. Они скрещивали растения или животных и наблюдали сходство между родителями и потомством. Результаты были обескураживающими: одни признаки могли быть общими у потомка с одним родителем, другие - с другим, третьи - отличными от обоих родителей.

Рис. 2.2. Семь признаков гороха Pisum sativum, наследование которых изучал Мендель. Мендель использовал растения, четко отличающиеся по одному признаку.

Глубокое проникновение в проблему и четкая методология обеспечили Менделю успех там, где его предшественники терпели неудачу. Он понял, что каждый раз следует концентрировать внимание на одном признаке, например на форме семян, а не на растении в целом. С этой целью он отобрал признаки, по которым растения четко отличались (рис. 2.2). Прежде чем скрещивать растения между собой, Мендель также убедился в том, что они принадлежат чистым линиям. Для этого он, получив от семеноводов множество различных разновидностей гороха, в течение двух лет разводил их, чтобы отобрать для своих опытов только те линии, в которых данный признак всегда воспроизводится в потомстве из поколения в поколение. Другой важной особенностью работы Менделя был количественный подход: он подсчитал число потомков разных типов, чтобы установить, с одинаковой ли частотой появляются носители альтернативных признаков.

Менделевский метод генетического анализа, - подсчет числа особей каждого класса в потомстве, полученном от определенного типа скрещивания, - по-прежнему широко используется. Фактически до возникновения в 50-х годах молекулярной генетики этот метод оставался единственным методом генетического анализа. Кроме разработки замечательной методологии научная гениальность Менделя проявилась в его способности сформулировать теорию, объясняющую данные экспериментов, и поставить эксперименты, подтверждающие эту теорию. Хотя концепция Менделя была представлена, строго говоря, в качестве гипотезы, в действительности это была завершенная теория. Время показало ее фундаментальную полноту и правильность.

Рассмотрим теперь постановку экспериментов Менделя, основные законы наследственности, следующие из этих экспериментов, и теорию, которая объясняет эти законы и описывает результаты экспериментов.

Доминантность и рецессивность

Горох размножается самоопылением: растения устроены таким образом, что пыльца обычно попадает на рыльце пестика того же цветка и опыляет его (рис. 2.3). Однако довольно просто можно произвести перекрестное опыление. Для этого Мендель раскрывал бутоны и удалял тычинки с еще не созревшей пыльцой, предотвращая тем самым самоопыление, а затем опылял этот цветок пыльцой другого растения. В одном из опытов Мендель изучал наследование формы семян, скрещивая растения с гладкими и морщинистыми горошинами. Результаты были однозначны: у всех гибридных растений первого поколения (F₁) семена оказались гладкими независимо от того, материнским или отцовским было растение с такими семенами. Морщинистость как бы маскировалась доминированием гладкости (рис. 2.4). Мендель обнаружил, что аналогичным образом ведут себя все семь признаков, отобранных им для исследования: в каждом случае у растений первого гибридного поколения проявлялся лишь один из двух альтернативных признаков. Мендель назвал такие признаки (гладкость семян, их желтый цвет, пазушные цветки и т.д.) доминантными, а альтернативные признаки (морщинистые семена, зеленые семена, верхушечные цветки) он назвал рецессивными.

Рис. 2.3. Цветок гороха Pisum sativum (в разрезе). Хорошо видны женские (пестик) и мужские (тычинки) репродуктивные органы.

Позднее ученые установили, что доминирование одних признаков над другими представляет собой широко распространенное, но не универсальное явление. В некоторых случаях имеет место неполное доминирование: гибрид F₁ характеризуется признаком, промежуточным между родительскими. Например, у львиного зева цветки гибридных растений первого поколения от скрещивания родителей с малиновыми и белыми цветками всегда бывают розовыми. Так получается просто потому, что в розовых цветах красного пигмента меньше, чем в малиновых, а в белых цветах его нет вовсе. Бывает также, что в потомстве F₁ проявляются признаки обоих родителей; в таком случае говорят о кодоминировании. Например, если один из родителей имеет группу крови А, а другой - В, то в крови их детей присутствуют антигены, характерные и для группы А, и для группы В; наличие этих антигенов может быть установлено соответствующей (антигенной) реакцией.

Рис. 2.4. Поколение F₁ в двух скрещиваниях Менделя. У гибридов первого поколения проявляется признак одного из родителей (доминантный), а альтернативный (рецессивный) признак второго родителя как бы маскируется. Результаты скрещивания не зависят от того, какое растение, отцовское или материнское, является носителем доминантного признака.

Расщепление

Мендель выращивал растения из семян гибридов первого поколения и допускал самоопыление этих растений. В полученном таким образом втором поколении от скрещивания между растениями с гладкими и морщинистыми семенами встречались как гладкие, так и морщинистые горошины; более того, разные горошины оказывались сидящими бок о бок в одних и тех же «стручках». Мендель подсчитал: на 5475 гладких семян пришлось 1850 морщинистых (рис. 2.5). Это отношение очень близко к 3:1 (точнее, 2,96:1). Близкие отношения наблюдались и при других скрещиваниях : каждый раз в поколении F₂ растений с доминантным признаком оказывалось примерно втрое больше, чем с рецессивным (табл. 2.1).

Рис. 2.5. Гибриды второго поколения (F₂) от скрещивания гороха с гладкими и морщинистыми семенами. А. При самоопылении растений f₁ с гладкими семенами или при перекрестном опылении между такими растениями в поколении F₂ примерно три четверти растений имеют гладкие семена, а одна четверть - морщинистые. Б. Предложенное Менделем объяснение. Буквы R и r обозначают альтернативные факторы (аллели), ответственные за гладкость и морщинистость семян соответственно. Вероятность появления любого типа растений можно узнать, перемножив вероятности для типов гамет, слияние которых приводит к формированию данного типа растений. Так, например, вероятность появления в F₂ растения типа RR равна одной четверти, поскольку с вероятностью 1/2 аллель R содержится в отцовской гамете и с такой же вероятностью - в материнской; откуда (1/2) -(1/2)= 1/4.

Таблица 2.1. Результаты опытов Менделя по скрещиванию растений гороха, различающихся по одному из семи признаков

		F ₂ (количество)			F₂ (%)
Признак*	F₁	Доминантные	Рецессивные	Всего	Доминантные	Рецессивные
Семена: гладкие либо морщинистые	Гладкие	5475	1850	7325	74,7	25,3
Семена: желтые либо зеленые Цветы: фиолетовые либо белые Цветы: пазушные либо верхушечные	Желтые Фиолетовые Пазушные	6022 705 651	2001 224 207	8023 929 858	75,1 75,9 75,9	24,9 24,1 24,1
Бобы: («стручки») выпуклые либо с перетяжками	Выпуклые	882	299	1181	74,7	25,3
Бобы: зеленые либо желтые Стебель: длинный либо короткий Всего или в среднем	Зеленые Длинный	428 787 14949	152 277 5010	580 1064 19959	73,8 74,0 74,9	26,2 26,0 25,1
* Доминантные признаки всегда указаны первыми.

Теперь Мендель мог определить, размножаются ли растения с гладкими и морщинистыми семенами из F₂ в чистоте, т.е. сохраняются ли эти признаки при самоопылении у всех потомков F₂ в следующих поколениях. Он проращивал семена F₂ и предоставлял получившимся растениям возможность самоопыляться. У растений, выросших из морщинистых семян, семена всегда были морщинистыми. Однако растения, полученные из гладких семян, вели себя совершенно иначе. Оказалось, что гладкие семена бывают двух типов, внешне совершенно неразличимых: примерно одна треть из них дает растения с такими же семенами, а в потомстве гладких семян другого типа (они составляют ²/з) гладкие и морщинистые семена встречаются в соотношении 3:1. Таким образом, одна треть гладких семян из F₂ (или одна четверть всех семян в F₂) в следующем поколении не дает расщепления, тогда как остальные две трети (или половина всех семян в F₂) ведут себя так же, как семена из первого гибридного поколения F₁: из них вырастают растения, в которых гладкие и морщинистые семена встречаются в соотношении 3:1.

Такие же результаты были получены и для других пар признаков. Во всех случаях растения с рецессивным признаком из F₂ размножались в чистоте: их потомки в следующем поколении (F₃) имели тот же фенотип. Что касается носителей доминантных признаков в F₂, то они были двух типов: одна треть разводилась в чистоте, а в потомстве остальных двух третей в F₃ носители доминантного и рецессивного признаков встречались в соотношении 3:1.

Рис. 2.6. Скрещивание между растениями львиного зева с белыми и малиновыми цветами. В fj цветы розовые, что свидетельствует о неполном доминировании малиновой окраски над белой. В F₂ растения с малиновыми, розовыми и белыми цветами представлены в отношении 1 : 2 : 1 .

Впоследствии было доказано, что результаты Менделя справедливы и для растений, и для животных, и человека. В случаях кодоминирования или неполного доминирования поколение F₂ состоит из трех классов: в четверти случаев проявляется признак одного родителя, в другой четверти - второго, а половину составляют особи, которые выглядят так же, как гибриды F_t. При этом особи, похожие на родителей, не дают в потомстве расщепления, тогда как при скрещивании гибридных особей в F₃ наблюдается такое же расщепление; по одной четверти особей совпадают по фенотипу с каждым из родителей, а половина особей имеет гибридное проявление признака (рис. 2.6 и 2.7).

Рис. 2.7. Наследование окраски оперения у андалузских кур. В f₁ окраска у кур серая, т.е. промежуточная между черной и белой окраской родителей. В F₂ соотношение черных, серых и белых кур 1 : 2 : 1 . Черные и белые куры из F₂ размножаются в чистоте, т.е. потомство от скрещивания между черными получается всегда черным, между белыми - белым. Скрещивание между серыми особями в F₂ снова дает в потомстве (на этот раз в F₃) расщепление на черных, серых и белых в отношении1 :2:1.

Гены - носители наследственности

Для объяснения результатов своих опытов с горохом Мендель выдвинул следующую гипотезу. Альтернативные признаки, такие как гладкость и морщинистость семян, определяются некими факторами (теперь их называют генами), передающимися от родителей потомкам с гаметами; каждый фактор может существовать в одной или нескольких альтернативных формах (ныне называемых аллелями), каждая из которых ответственна за одну из возможных альтернативных форм проявления признака. В каждом растении гороха содержатся два гена, обусловливающие проявление любого признака; один получен от отцовского растения, а другой - от материнского. Таким образом, в каждом растении гороха есть два гена, влияющие на форму семян ; каждый из них может быть либо в форме, определяющей гладкость горошин (аллель гладкости), либо в форме, определяющей их морщинистость (аллель морщинистости).

Рис. 2.8. Гомозиготные и гетерозиготные особи различных видов организмов. Гомозиготы имеют два идентичных аллеля гена, определяющего данный признак; у гетерозиготы аллели разные.

Здесь нам следует ввести еще два генетических термина. Гомозиготой (или гомозиготной) называется особь, у которой два гена, определяющие данный признак, идентичны, т.е. особь с идентичными аллелями. Гетерозиготой (или гетерозиготной) называется особь, у которой два гена, определяющие данный признак, различны, т. е. особь содержит два разных аллеля. Таким образом, размножающиеся в чистоте растения с гладкими семенами гомозиготны по этому признаку, а растения с морщинистыми семенами, в потомстве которых все семена морщинистые, гомозиготны по данному признаку. Гибриды F₁ от скрещивания между растениями, гомозиготными по гладкости и морщинистости, гетерозиготны по соответствующим аллелям (рис. 2.8).

Единообразие гибридов первого поколения привело Менделя к заключению, что в гетерозиготных особях один аллель доминантен, а другой рецессивен. Из того факта, что в потомстве гибридов (гетерозигот) встречаются носители обоих родительских признаков, Мендель сделал вывод, что два фактора (гена), определяющие альтернативные проявления признака, никоим образом не сливаются друг с другом, а остаются раздельными на протяжении всей жизни особи и при формировании гамет расходятся в разные гаметы, так что половина гамет получает один ген, а половина - второй. Это утверждение называется законом расщепления Менделя.

Пары генов часто обозначают буквами, причем для обозначения доминантного аллеля используется прописная буква латинского алфавита, а для рецессивного -соответствующая строчная. Например, аллель гладкости семян обычно обозначается буквой R, а аллель морщинистости -буквой r. Соответственно гомозиготные растения с гладкими семенами получают обозначение RR, а с морщинистыми - rr. Гибриды первого поколения F₁ записываются как Rr; они производят гаметы двух типов R и r в равных количествах. При самоопылении растения с генотипом Rr (или при его опылении пыльцой такого же растения) возникают потомки трех типов: (1) ¹/₄ - это растения с гладкими семенами, не дающие в потомстве расщепления (RR); (2) половину потомства составляют растения с гладкими семенами, которые, однако, при самоопылении дают в потомстве (т.е. в поколении F₃) растения как с гладкими, так и с морщинистыми семенами (Rr), и, наконец, (3) одна четверть растений имеет морщинистые семена. Это гомозиготы rr, они производят гаметы одного-единственного типа.

Рис. 2.9. Анализирующим скрещиванием называется скрещивание гибрида F₂ с рецессивным родителем. На рисунке представлены результаты скрещивания гибрида F₁ между формами с гладкими и морщинистыми семенами (Rr) с растением, обладающим морщинистыми горошинами (rr). Мендель обнаружил, что в таком скрещивании в соответствии с его гипотезой примерно половина потомков имеет гладкие семена, как гибридный родитель, а вторая половина - морщинистые, как рецессивный родитель.

Мендель проверял свою гипотезу различными способами. Один из них, впоследствии широко применявшийся генетиками, называется анализирующим скрещиванием (рис. 2.9). Для этого гибридные особи F₁скрещивают с их рецессивным родителем. Если гипотеза Менделя справедлива, то в потомстве от такого скрещивания особи с рецессивным и доминантным признаками должны быть представлены примерно в одинаковом количестве. Результат полностью соответствовал ожидаемому.

Независимое комбинирование

Описанные нами опыты Менделя относятся лишь к наследованию альтернативных проявлений одного признака. А что происходит, когда одновременно рассматриваются два признака? Мендель сформулировал закон независимого комбинирования, который гласит, что гены, определяющие различные признаки, наследуются независимо друг от друга. (Впоследствии, однако, было показано, что этот закон справедлив только для генов, находящихся в разных хромосомах.)

Мендель вывел этот закон из результатов скрещивания растений, отличавшихся по двум различным признакам (такое скрещивание называется дигибридным). В одном из опытов растения с гладкими желтыми семенами он скрещивал с растениями, семена которых были морщинистыми и зелеными. Как и следовало ожидать, в F₁ семена всех растений были гладкими и желтыми. Очень интересные результаты были получены при анализе гибридов второго поколения (F₂). Мендель заранее рассмотрел две возможности: (1) признаки, наследуемые от каждого родителя, передаются потомству вместе; (2) признаки передаются независимо друг от друга. Со свойственной ему четкостью Мендель сформулировал следствия, вытекающие из этих альтернативных гипотез. Если справедлива первая гипотеза, то в F₂ должны быть только два типа растений-с гладкими желтыми семенами и с морщинистыми зелеными, причем в соответствии с законом расщепления эти два типа растений должны быть представлены в отношении 3:1. Если же справедлива вторая гипотеза, то семена должны быть четырех типов: гладкие желтые (два доминантных признака), гладкие зеленые (доминантный и рецессивный), морщинистые желтые (рецессивный и доминантный) и морщинистые зеленые (два рецессивных признака). Численности соответствующих классов должны находиться в соотношении 9:3:3:1 (рис. 2.10).

Мендель обнаружил, что в поколении F₂ присутствуют четыре типа семян, а именно: 315 гладких желтых, 108 гладких зеленых, 101 морщинистое желтое и 32 морщинистых зеленых. Этот результат довольно хорошо совпадал с предсказанным на основе второй гипотезы отношением 9 :3 :3 :1, и Мендель пришел к заключению, что гены, определяющие различные признаки, передаются от родителей потомками независимо. (Заметим, что результаты этого опыта подтверждают также закон расщепления, поскольку ожидаемое отношение 3 : 1 хорошо соблюдается для каждого отдельно взятого признака. В поколении F₂ гладких семян оказалось 423, а морщинистых - 133 ; соотношение желтых и зеленых составило 416:140.)

Рис. 2.10. Независимое комбинирование. Растения с гладкими желтыми семенами (RRYY) скрещивали с растениями, семена которых были морщинистыми и зелеными (rrуу). В поколении F₁ растения имели гладкие желтые семена (RrYy). У них возникают гаметы четырех типов, частота каждого составляет 1/4. Случайное сочетание четырех типов мужских и женских гамет дает в F₂ девять различных генетических классов. Схема образования различных типов зигот из гамет представлена на рисунке. С точки зрения внешнего проявления признаков из 16 клеточек девять соответствуют гладким желтым горошинам, три - гладким зеленым, три -морщинистым желтым и одна -морщинистым зеленым. Таким образом, эти четыре типа должны быть представлены в отношении 9:3:3:1. У Менделя число растений соответствующих типов составляло 315, 108, 101 и 32, что хорошо соответствует предсказаниям гипотезы.

Тригибридные скрещивания

Мендель проверял закон независимого комбинирования на различных комбинациях пар признаков. Он подтвердил также этот закон, поставив опыт по скрещиванию растений, отличавшихся сразу по трем признакам. Такое скрещивание называется тригибридным.

Рассмотрим, например, скрещивание между двумя растениями гороха со следующими признаками:

Материнское растение:

гладкие семена (RR)

желтые семена (У У)

пурпурные цветы (СС)

Отцовское растение:

морщинистые семена (rr)

зеленые семена (уу)

белые цветы (cc)

Материнское растение продуцирует гаметы типа RYC, отцовское — rус, следовательно, гибриды F₁ будут тройными гетерозиготами или тригибридами, принадлежащими к генетическому типу RrYyCc. Вследствие доминантности семена у таких растений будут гладкими и желтыми, а цветы - пурпурными. Если все гены передаются независимо, то в тригибридном растении образуется восемь типов гамет, причем все с равной вероятностью (рис. 2.11).

Рис. 2.11. Гаметы, образующиеся у тригибридной особи. В отношении каждого гена вероятность одного из двух типов гамет равна 1/2. При одновременном рассмотрении всех трех генов возможны восемь типов гамет. Если все гены наследуются независимо, то вероятность каждого типа гамет составляет (1/2) ·(1/2)·(1/2) = 1/8.

Рис. 2.12. Генотипы, возникающие в потомстве тригибридных особей при их самоопылении или перекрестном опылении. Существуют 64 комбинации восьми отцовских и восьми материнских гамет, но соответствуют они лишь 27 различным генотипам. В рассмотренном на схеме случае доминирования эти 27 генотипов соответствуют восьми различным фенотипам. В опытах Менделя тригибридные растения могли быть получены в результате скрещивания растений с гладкими желтыми семенами и пурпурными цветами и растений с морщинистыми зелеными семенами и белыми цветами.

Случайное слияние гамет восьми типов от двух родителей приводит к возникновению 27 различных генетических классов (рис. 2.12). Вследствие доминантности этим 27 генетическим классам соответствуют всего лишь 8 типов внешне различающихся растений, представленных в следующем отношении (названия доминантных признаков выделены жирным шрифтом):

27 гладкие желтые пурпурные

9 гладкие желтые белые

9 гладкие зеленые пурпурные

9 морщинистые желтые пурпурные

3 гладкие зеленые белые

3 морщинистые желтые белые

3 морщинистые зеленые пурпурные

1 морщинистые зеленые белые

Теперь мы можем сформулировать некоторые общие правила относительно потомства гибридов, полученных от скрещивания особей, отличающихся определенным числом генов (табл. 2.2). В общем случае каждый новый ген увеличивает число типов различных гамет вдвое, а число генетических классов (генотипов) втрое. Таким образом, особь, гетерозиготная по n парам генов, может произвести 2ⁿ типов гамет и 3ⁿразличных генотипов. Число внешне различающихся классов (фенотипов) равно числу различных типов гамет при наличии доминирования и числу различных генотипов в отсутствие доминирования.

Существует также несложная процедура, с помощью которой можно вычислить частоту данного генотипа в потомстве родителей, отличающихся определенным числом независимо наследуемых генов. Для этого надо подсчитать вероятности соответствующего генотипа для каждой пары генов отдельно, а затем перемножить. Допустим, мы хотим рассчитать ожидаемую частоту генотипа RryyCc в потомстве от скрещивания RrYycc х RrYyCc. Вероятность генотипа Rr в потомстве от скрещивания Rr х Rr равна ¹/₂; вероятность генотипа уу в потомстве от скрещивания Yy x Yy равна ¹/₄; наконец, вероятность генотипа Сс в потомстве от скрещивания cс x Cс равна также ¹/₂. Следовательно, вероятность генотипа RryyCc составляет (¹/₂)·(¹/₄)·(¹/₂) = ¹/₁₆·

Таблица 2.2. Число различных типов гамет в F_t и различных генотипов в F 2 при скрещивании особей, гомозиготных по двум различным аллелям определенного числа генов

Число

генов

Число типов

гамет

Число

генотипов

Число

фенотипов¹⁾

2 ⁿ

3ⁿ

2 ⁿ

¹⁾ При доминировании: в отсутствие доминирования число различных фенотипов совпадает с числом генотипов.

Множественные аллели

Примеры наследования признаков, которые обсуждались до сих пор в этой главе и основывались на собственных опытах Менделя, касаются двухаллельных генов. Однако многие гены имеют несколько аллелей (множественный аллелизм), хотя каждый конкретный диплоидный орга- низм может быть носителем не более двух аллелей.

Известно большое число примеров множественного аллелизма; с не- которыми из них мы еще будем встречаться в этой книге. Одним из примеров может служить серия аллелей гена кролика, определяющего окраску меха; четыре из них приведены в табл. 2.3. Аллель дикого типа с⁺ доминантен по отношению к трем остальным: кролики, гомози- готные по с ⁺ или гетерозиготные по с ⁺ и любому другому аллелю, имеют обычную для этих животных серую (агути) окраску (или окраску дикого типа). У особей, гомозиготных по аллелю с^сh , мех по цвету напоминает мех шиншиллы и несколько светлее дикого типа. У гетерозигот по аллелям c^ch и с^h или с^а мех светло-серый (промежуточный между шиншилловым и белым); аллель с проявляет, следовательно, неполное доминирование по отношению к аллелям с^h и с^а. Гомозиготы с^hс^hи гетерозиготы с^hс^a - это кролики так называемого гималайского фенотипа, мех у них белый всюду, кроме лап, хвоста, ушей и кончика носа. Гомозиготы по аллелю с^а имеют типично альбиносный фенотип: белый мех и розовые глаза (рис. 2.13).

Таблица 2.3. Генетическое определение окраски меха у кроликов

Аллель	Генотип	Фенотип
		Дикий тип
		Шиншилла
		Светло-серый
		Гималайский
		Альбинос

Рис. 2.13. Четыре фенотипа, возникающие при различных комбинациях алле- лей гена окраски меха кроликов.

Рис. 2.14. Антигенные реакции, используемые при определении группы крови в системе АВО. В качестве тестера применяются сыворотки крови каждой из четырех групп. Наблюдается реакция, происходящая при смешении капли исследуемой крови с пробным раствором. Например, кровь человека с группой О не агглютинируется ни одним из четырех типов сыворотки, а кровь человека группы А агглютинируется сыворотками групп О и В. На агглютинацию указывает появление хлопьев.

Другим примером множественного аллелизма может служить система групп крови АВО, открытая Карлом Ландштейнером (1868-1943) в 1900 году. Группы крови важно учитывать при подборе доноров для переливания крови, чтобы избежать слипания эритроцитов донора при их попадании в кровоток реципиента (рис. 2.14).

Существуют четыре группы крови системы АВО : О, А, В и АВ. Они определяются тремя аллелями одного гена : I^А , I^В и i. Аллели I^А и I^В доминантны по отношению к аллелю i, но кодоминантны по отношению друг к другу. При наличии трех аллелей возможно шесть генотипов; рецессивность i сводит число групп крови к четырем (табл. 2.4).

Дополнение 2.1. Генетические обозначения

Система генетических обозначений развивалась без твердых заранее установленных правил, и это часто приводило к путанице. Генетики, работавшие с каким-либо определенным видом организмов, мало заботились о том, чтобы применяемые ими обозначения согласовывались с обозначениями, используемыми генетиками, работающими на других объектах. Ниже описываются принципы, которым мы будем следовать в этой книге при обозначении аллелей и генотипов.

Если известны лишь два аллеля какого-то гена, то принято обозначать доминантный аллель курсивной прописной буквой латинского алфавита, а рецессивный-строчной. Например, три возможных диплоидных генотипа для пары аллелей А и α обозначаются как АА, Аа и аа. Однако в случае нескольких аллелей одного гена или когда известны независимые мутации гена, приводящие к одному мутантному фенотипу, обычно используются другие обозначения. Для обозначения гена или локуса используются курсивные строчные буквы (или группы букв), а аллели обозначаются индексом, помещаемым справа сверху. Например, буква с может обозначать ген окраски меха кролика. Нормальный аллель или аллель дикого типа (который часто бывает наиболее доминантным в серии множественных аллелей) обозначается символом с ⁺ , a другие аллели -символами с^ch, с^h, с^a и т.д. Часто обозначение с⁺ сокращают до знака « + ».

При обозначении диплоидных генотипов мы обычно используем косую черту, чтобы показать, что каждый из двух аллелей находится в одной из двух гомологичных хромосом, например c^ch/c ⁺ или c^ch/ + . Удобство такого обозначения более очевидно при рассмотрении нескольких генов, расположенных в разных

локусах одной хромосомы (см. гл. 5). Например, рецессивная мутация scarlet(st) в гомозиготном состоянии (st/st) определяет ярко-красный (алый) цвет глаз дрозофилы, тогда как доминантный аллель дикого типа st⁺ обусловливает темнокрасный цвет глаз. Рецессивная мутация ebony(e) в гомозиготном состоянии (е/е) определяет темный цвет тела, а соответствующий доминантный аллель дикого типа е⁺ -коричневато-желтый. Соответствующие два локуса расположены в одной хромосоме, и возможны два типа двойных гетерозигот, а именно st ⁺ е ⁺ /st е и st⁺ e/st e⁺. В первом случае говорят, что аллели st и е находятся в цис-положении (т. е. расположены в одной из гомологичных хромосом), а во втором случае -в транс-положении (расположены в различных гомологичных хромосомах).

Изредка могут происходить доминантные мутации. Сочетания букв, обозначающие такие мутации, часто начинают прописной буквой. Например, мутация Ваr, определяющая полосковидную форму глаз у дрозофилы, доминантна по отношению к соответствующему аллелю дикого типа, обозначаемому символом В ⁺ .

При обозначении аллелей, определяющих у человека группы крови системы АВО, используется необычная смешанная система обозначений: символы I^А и I^В соответствуют кодоминантным аллелям, а буква г обозначает рецессивный аллель, в гомозиготном состоянии определяющий группу крови О.

Описанные выше обозначения применяются как для гаплоидных, так и диплоидных генотипов эукариотических организмов. Обозначения, используемые в генетике бактерий, основаны на других правилах, которые будут изложены в главе 8.

Таблица 2.4. Группы крови системы АВО			Таблица 2.5. Число различных генотипов при заданном числе аллелей
Аллель	Генотип	Фенотип (группа крови)	Аллели	Генотипы	Гомозиготы	Гетерозиготы

Количество различных генотипов при множественном аллелизме зависит от числа аллелей. Если аллель один, А, то и генотип один, АА. Если аллеля два, A₁ и А₂, то возможно три генотипа: два типа гомозигот а₁а₁ и А₂А₂ и гетерозиготы А₁А₂. При трех аллелях A₁, A₂ и А₃возможно шесть генотипов: три типа гомозигот А₁А₁, А_гА_г и А₃А₃и три типа гетерозигот А₁А₂, А₁А₃ и А₂А₃. В общем случае при n аллелях возможно n(n + 1)/2 генотипов, из которых n-гомозиготы, а остальные n(п — 1)/2-гетерозиготы (табл. 2.5).

Генотип и фенотип

В 1909 году Вильгельм Иоганнсен сформулировал важное различие между фенотипом и генотипом. Фенотип организма-это совокупность внешних признаков, тех, которые мы можем наблюдать: морфология, физиология и поведение. Генотип - это наследуемая генетическая организация. На протяжении жизни организма его фенотип может изменяться, генотип же остается неизменным.

О различии между фенотипом и генотипом нужно всегда помнить, поскольку соответствие между ними не однозначное. Причина этого состоит в том, что фенотип представляет собой результат сложной сети взаимодействий между различными генами и между генами и окружающей средой.

Вообще говоря, никакие две особи не обладают тождественными фенотипами, хотя и могут быть одинаковыми в отношении одного или нескольких рассматриваемых признаков. Более того, особи, обладающие одинаковыми фенотипами в отношении какого-либо признака, не обязательно одинаковы генотипически. Например, желтые горошины могут быть как у растения, гомозиготного по аллелю «желтизны», так и у гетерозиготы по «желтому» и «зеленому» аллелям.

В природе широко распространено генетическое разнообразие. За исключением однояйцевых (монозиготных) близнецов, развивающихся из одной оплодотворенной яйцеклетки, никакие два размножающихся половым путем организма не могут иметь полностью тождественные генотипы, хотя в отношении отдельных генов их генотипы могут быть идентичными (см. гл. 22). С другой стороны, в результате бесполого размножения данной особи возникают организмы, генетически тождественные друг другу и своему родителю. Однако даже организмы с тождественными генотипами вследствие различий во взаимодействиях с окружающей средой могут обладать различными фенотипами. Например, однояйцевые близнецы могут различаться весом, ростом и продолжительностью жизни; эти различия отражают различия в условиях их жизни (рис. 2.15 и табл. 2.6).

Рис. 2.15. Три пары однояйцевых близнецов несколько различной внешности.

Хороший пример влияния внешней среды на фенотип представлен на рис. 2.16. Три растения лапчатки (Potentilla glandulosa) были отобраны в Калифорнии, одно на высоте 30 м над уровнем моря, второе - на высоте около 1400 м, а третье - в зоне альпийских лугов в горах СьерраНевада на высоте около 3000 м. Каждое растение разрезали на три части, и каждую часть высадили отдельно в одном из трех ботанических садов, расположенных на различной высоте. Растения разделили на части для того, чтобы была уверенность в генетической идентичности растений, выращиваемых в различных условиях.

Сравнение растений в столбцах показывает, что один и тот же генотип в различных условиях определяет различные фенотипы. Эти различия относятся не только к внешним морфологическим признакам, но и к плодовитости, скорости роста и т. п. Сравнение растений в горизонтальных рядах показывает, что при фиксированных внешних условиях генетические различия влекут за собой фенотипические. Из этого опыта следует важный вывод: не существует единственного генотипа, наилучшего при любых условиях. Например, растение, взятое почти с уровня моря, где оно процветало, оказалось неспособным существовать на высоте 3000 м, а растение, взятое с этой высоты, где оно также чувствовало себя прекрасно, вблизи от уровня моря чахло.

Таблица 2.6. Конкордантность и дискордантность (в %) некоторых заболеваний у однояйцевых близнецов. (Конкордантность -заболевание обоих близнецов при заболевании одного из них)
Заболевание	Число обследованных пар	Конкордантность	Дискордантность
Корь	189	95	5
Скарлатина	31	64	36
Туберкулез	190	74	26
Некоторые типы
опухолей	62	58	42
Диабет	63	84	16
Слабоумие	126	91	9

Рис. 2.16. Влияние генотипа и среды на фенотип. Части трех растений Potentilla grandulosa, выросших на различной высоте над уровнем моря, культивировали в трех различных ботанических садах. Растения в горизонтальных рядах генетически тождественны, поскольку они выросли из частей одного и того же растения. Растения в вертикальных столбцах генетически различны, но выращивались в одинаковых условиях. Генетически тождественные растения (например, представленные в нижнем ряду) могут процветать или погибать в зависимости от внешних условий. Генетически различные растения (например, представленные в левом столбце) могут обладать совершенно различными фенотипами, несмотря на то что выращиваются они в совершенно одинаковых условиях.

Рис. 2.17. Результаты опыта с двумя линиями крыс. Крысы первой линии отбирались на «сообразительность», вторая линия представлена самыми «глупыми» крысами. Когда крыс обеих линий содержали в тех же условиях, в которых происходил отбор (т.е. в «нормальных» условиях), то «умные» крысы при прохождении лабиринта делали примерно на 45 ошибок меньше, чем их «глупые» сородичи. Однако когда крысы выращивались в неблагоприятных условиях, то представители обеих линий совершали при прохождении лабиринта одинаковое число ошибок. При выращивании крыс в комфортных условиях число ошибок было почти одинаковым.

Взаимодействие между генотипом и средой иллюстрируется также результатами эксперимента, представленными на рис. 2.17. Были выведены две линии крыс: быстрее всех находившие выход из лабиринта и медленнее всех. В каждом поколении отбирались самые «умные» и самые «глупые» крысы. Потомство каждых составляло следующее поколение, в котором отбор проводился таким же образом. После многих поколений отбора «умные» крысы при прохождении лабиринта совершали лишь около 120 ошибок, тогда как «глупые» - в среднем по 165 ошибок. Однако эти различия ярко проявлялись лишь когда крыс выращивали в обычных условиях. Различия полностью исчезали, если крыс выращивали в крайне неблагоприятных условиях, и почти сглаживались, когда животных содержали, наоборот, в высшей степени комфортных условиях и с точки зрения обеспеченности пищей, и в других отношениях. Как и в случае с растениями лапчатки, мы видим, что, вопервых, данный генотип в различных условиях приводит к формированию различных фенотипов и, во-вторых, фенотипические различия между двумя генотипами меняются в зависимости от условий: генотип, выгодный в одних условиях, может не оказаться таким в других.

Различные взаимодействия с окружающей средой приводят к тому, что фенотип особи не определяется однозначно его генотипом. Генотип определяет скорее спектр возможных фенотипов; это фенотипическое разнообразие называется нормой реакции генотипа. Какой именно фенотип сформируется при данном генотипе, зависит от условий, в которых происходит развитие. По этой причине полная норма реакции любого генотипа всегда остается неизвестной, поскольку определение такой нормы реакции подразумевало бы определение разнообразия фенотипов, которое можно получить из данного генотипа при всех возможных вариантах условий развития, а число таких вариантов фактически бесконечно.

Литература

Clausen J., Keck D.D., HieseyW.M., 1940. Experimental studies on the nature of species. I. Effects of varied environments on western North American plants, Carnegie Institution of Washington Publ., No. 520, Washington, D. C., pp. 1-452.

Cooper R.M., ZubekJ.P. (1958). Effects of enriched and restricted early environments on the learning ability of bright and dull rats, Can. J. Psych., 12, 159-164.

Dunn L. C., éd., 1951. Genetics in the 20th Century, Macmillan, New York.

Levine L., 1971. Papers on Genetics, Mosby, St. Louis.

Mendel G., Experiments in plant hybridization. English translation of Mendel's classic work. Reprinted, for example, in the following collections by Peters and by Stern and Sherwood.

Peters J.A., éd., 1959. Classic Papers in Genetics, Prentice-Hall, Englewood Cliffs, N.J.

Stern C., Sherwood E. R., eds., 1 966. The Origin of Genetics, W. H. Freman, San Francisco.

Sturtevant A.H., Beadle G. W., 1940. An Introduction to Genetics, Saunders, Philadelphia.

Ключевые слова и понятия

Аллель

Анализирующее скрещивание

Ген

Генотип

Гетерозигота

Гомозигота

Дигибридное скрещивание

Дикий тип

Доминантность

Закон независимого комбинирования

Кодоминирование

Множественные аллели

Неполное доминирование

Норма реакции

Пангенез

Поколение F₁

Поколение F₂

Рецессивность

Соматоплазма

Тригибридное скрещивание

Фенотип

Задачи

Замечание: метод хи -квадрат описан в Приложении I: теория вероятности и статистика.

2.1. Мендель установил, что пазушное положение цветов -признак доминантный по отношению к их верхушечному поло-

жению. Обозначим аллель пазушного положения А, а верхушечного - а. Каковы типы и соотношения гамет и потомства в каждом из следующих скрещиваний:

АА х аа, АА х Аа, Аа х аа, Аа х Аа!

2.2. Генетик, работающий с морскими свинками, 'поставил два скрещивания между черной особью и альбиносом, используя в этих скрещиваниях различных животных. В потомстве первого скрещивания оказалось 12 черных морских свинок, а второго - 6 черных и 5 альбиносов. Каковы возможные генотипы родителей в каждом скрещивании?

2.3. У двух самок морской свинки: альбиноса и гомозиготы по черной окраске -хирургическим путем были пересажены яичники. После скрещивания с самцом-альбиносом у самки-альбиноса родились два черных детеныша. Согласуется ли этот результат с теорией пангенеза? С менделевской теорией наследственности ?

2.4. Двух черных самок крысы скрещивали с коричневым самцом. Было получено по нескольку пометов от каждой самки. Потомство первой самки составляли 36 черных особей, потомство второй -14 черных и 10 коричневых. Каков вероятный механизм наследования черной и коричневой окраски у крыс? Каковы генотипы родителей? Для проверки ваших гипотез используйте метод хи-квадрат.

2.5. Генетик произвел самоопыление у шести зеленых растений определенной линии кукурузы и полученные зерна каждого растения прорастил. В потомстве каждого растения оказались зеленые и альбиносные (лишенные хлорофилла) растения в следующей пропорции:

Каков вероятный механизм наследования альбинизма у кукурузы? Каковы генотипы родительских растений? Используйте метод хи-квадрат, проверяя вашу гипо-

тезу применительно к каждому родительскому растению.

2.6. Растения кукурузы той же линии, что и в условиях предыдущей задачи, опыляли пыльцой растений другой линии. Из полученных семян выросли 20 зеленых и 10 белых растений. Какому расщеплению соответствует этот результат, 3 : 1 или 1 : 1 ? Каков вероятный генотип отцовского растения?

2.7. У кур розовидный гребень - признак, доминантный по отношению к простому гребню. Фермер полагает, что некоторые из его кур-виандотов с розовидным гребнем являются носителями аллеля простого гребня. Как он может установить, какие из кур гетерозиготны ?

2.8. Существует заболевание, при котором в возрасте между 10 и 20 годами начинается постепенная атрофия дистальных отделов мышц ног. Изучение родословных показывает, что во всех случаях той же болезнью страдал один из родителей больного. Каков вероятный механизм наследования этого заболевания?

2.9. Существует еще более тяжелая форма того же заболевания. Эта форма обнаруживается почти исключительно у детей, родители которых являлись двоюродными братом и сестрой и сами не страдали от этого заболевания. Как наследуется этот тип мышечной атрофии?

2.10. Мужчина с группой крови А женился на женщине с группой крови В, и у них родился ребенок с группой крови О. Каковы генотипы всех трех? Какие еще генотипы и с какими частотами можно ожидать -в потомстве от таких браков?

2.11. В таблице 2.1 представлено число потомков различного типа, полученных в каждом из семи проводившихся Менделем опытов в поколении F₂. Используя метод хи-квадрат, проверьте в каждом случае, соответствуют ли приведенные числа гипотезе о расщеплении в отношении 3:1.

2.12. У морских свинок аллель черной окраски В доминантен по отношению к аллелю альбинизма b, a аллель грубошерстности R доминантен по отношению к аллелю гладкошерстности r. Гены R и

В независимы. Каковы будут результаты скрещивания между гомозиготой по генам черной окраски и грубошерстности с гладкошерстным животным-альбиносом в F₁?ВF₂?А скрещивания между F₁и гладкошерстным родителем-альбиносом? 2.13. Черную грубошерстную морскую свинку скрещивали с грубошерстным альбиносом (см. условие предыдущей задачи). В потомстве оказалось 13 черных грубошерстных, 16 грубошерстных альбиносов, 6 черных гладкошерстных и 5 гладкошерстных альбиносов. Определите генотипы родителей и проверьте вашу гипотезу, используя метод хи-квадрат. 2.14. У Drosophila melanogaster существует рецессивный аллель, приводящий к развитию коротких рудиментарных крыльев vg; соответствующий доминантный аллель (vg ⁺ ) обусловливает формирование нормальных крыльев. В другом генном локусе существует рецессивный аллель st, вызывающий алый цвет глаз; соответствующий доминантный аллель (st ⁺ ) отвечает нормальному красному цвету. Полученное в трех различных опытах потомство описано ниже. Определите генотипы родителей, используя для проверки гипотез метод хи-квадрат.

Фенотип потомства
Фенотип родителей	Длинные крылья, красные глаза	Длинные крылья, алые глаза	Короткие крылья, красные глаза	Короткие крылья, алые глаза
1. Длинные крылья, красные глаза x короткие крылья, алые глаза	178	164	142	140
2. Длинные крылья красные глаза x длинные крылья, красные глаза	364	0	107	0
3. Длинные крылья, красные глаза x длинные крылья красные глаза	309	107	95	29

2.15. У кунжута одинарный плод - признак, доминантный по отношению к тройному, а нормальный (гладкий) лист - признак, доминантный по отношению к морщинистому листу. Оба признака наследуются независимо. Каковы генотипы родителей в каждом из пяти перечисленных ниже опытов?

Фенотип потомства
Фенотип родителей	Одинарный, нормальный	Одинарный, морщинистый	Тройной, нормальный	Тройной, морщинистый
Одинарный, нормальный x x тройной, нормальный	362	118	0	0
Одинарный, нормальный x x тройной, морщинистый	211	0	205	0
Одинарный, морщинистый x x тройной, нормальный	78	90	84	88
Одинарный, нормальный x x тройной, нормальный	318	98	323	104
Одинарный, нормальный x x одинарный, морщинистый	110	113	33	38

2.16. Каково число различных типов гамет, генотипов и фенотипов в потомстве самоопыляющегося растения, гетерозиготного по трем, пяти и семи различным доминантным генам?

2.17. Растение, гетерозиготное по четырем независимо наследуемым парам генов (AaBbCcDd), самоопыляется. Определите ожидаемые частоты следующих генотипов в потомстве этого растения: 1) aabbccdd, 2) aabbccDd, 3) AaBbCcDd.

2.18. У одного из видов дрозофилы известно семь аллелей гена, кодирующего фермент фосфатазу. Каково число различных генотипов по этому гену?

2.19. Какую долю всех возможных генотипов составляют гомозиготы, когда число различных аллелей данного гена равно трем? Пяти? Семи?

2.20. Скрещивали крыс дикого фенотипа (агути, гладкие, темноглазые, с неослабленной окраской) с черными, пятнистыми, красноглазыми крысами, имеющими ослабленную окраску. В поколении F₁ все крысы имели окраску дикого типа.

Их скрещивали с черными, пятнистыми, рубиновоглазыми крысами, окраска которых ослаблена. Было получено следующее потомство (если признак не обозначен, это означает, что он относится к дикому типу):

Объясните результаты. В каких пропорциях будут представлены эти фенотипы в потомстве от скрещивания F₁ x F₁?

3. Хромосомные основы наследственности

Гены и хромосомы

Всякий раз, когда выясняется, что две, казалось бы, разные области науки на самом деле взаимосвязаны, факты, накопленные в каждой из них, можно использовать для объяснения явлений, изучаемых в другой области. Такой подход, как правило, приносит успех. Именно это и произошло, когда было показано, что менделевская генетика и процессы митоза и мейоза связаны между собой. В 1902 г. два исследователя — Вальтер Саттон в США и Теодор Бовери в Германии - независимо друг от друга предположили, что гены расположены в хромосомах, и эта идея положила начало хромосомной теории наследственности. Аргументом в пользу такого предположения был параллелизм в поведении в процессах мейоза и оплодотворения хромосом, с одной стороны, и генов - с другой. Существование двух аллелей данного признака, один из которых наследуется от одного родителя, а другой - от второго, соответствует существованию двух хромосом, каждая из которых приходит от одного из родителей. Два аллеля каждого признака расходятся при формировании гамет, поскольку гомологичные хромосомы каждой пары попадают в процессе мейоза в разные гаметы (рис. 3.1). Некоторые гены, определяющие различные признаки, наследуются и комбинируются независимо, поскольку они расположены в негомологичных хромосомах, а эти хромосомы комбинируются в гаметах независимо от того, от какого из родителей они были получены (рис. 3.2).

Параллелизм в поведении генов и хромосом в процессе образования гамет и оплодотворении убедительно свидетельствовал в пользу предположения, что гены расположены в хромосомах. Еще более неотразимым доказательством справедливости хромосомной теории наследственности стало обнаружение взаимосвязи между конкретными генами и конкретными хромосомами. Существование такой связи было впервые продемонстрировано в опытах, поставленных Нобелевским лауреатом Томасом Хаитом Морганом в 1910 году и его студентом и сотрудником Кальвином Бриджесом в 1916 году. Эти эксперименты были проделаны на Drosophila melanogaster- маленькой желтовато-коричневой плодовой мушке, скопления которой можно видеть летом и ранней осенью вокруг опавших и прелых фруктов (рис. 3.3 и 3.4).

Рис. 3.1. Хромосомная основа закона расщепления Менделя. Пример иллюстрирует скрещивание растений с гладкими и морщинистыми семенами. Изображены только две пары хромосом, в одной из этих пар находится ген, ответственный за форму семян. У растений с гладкими семенами мейоз приводит к образованию гамет с аллелем гладкости OR), a y растений с морщинистыми семенами -гамет с аллелем морщинистости (r). Гибриды первого поколения F₁ имеют одну хромосому с аллелем гладкости и одну — с аллелем морщинистости. Мейоз в F₁ приводит к образованию в равном числе гамет с R и с r. Случайное попарное объединение этих гамет при оплодотворении приводит в поколении F₂ к появлению особей с гладкими и морщинистыми горошинами в отношении 3:1.

Рис. 3.2. Закон независимого комбинирования как следствие независимого расхождения негомологичных хромосом в мейозе. Скрещивание растений, отличающихся по форме и цвету семян (гладкие желтые x зеленые морщинистые), дает гибридные растения, у которых в хромосомах одной гомологичной пары содержатся аллели R и r, а другой гомологичной пары -аллели F и у. В метафазе I мейоза хромосомы, полученные от каждого из родителей, могут с равной вероятностью отходить либо к одному и тому же полюсу веретена (левый рисунок), либо к разным (правый рисунок). В первом случае возникают гаметы, содержащие те же комбинации генов (YR и уr), что и у родителей, во втором случае -альтернативные сочетания генов (Yr и yR). В результате с вероятностью 1/4 образуются четыре типа гамет, случайная комбинация этих типов приводит к расщеплению потомства 9:3:3:1, как это и наблюдалось Менделем.

Рис. 3.3. Плодовая мушка Drosophila теlanogaster размножается, питаясь опавшими фруктами и продуктами бродильных производств. Это мелкое насекомое длиной около двух миллиметров и весом около одного миллиграмма с желтовато-коричневым телом и красными глазами. Дрозофила - очень распространенный и удобный объект генетических исследований, поскольку время генерации у этих мух очень мало (около двух недель), а численность потомства велика (несколько сотен от каждого скрещивания). Дрозофилы легко разводятся в лабораторных условиях.

Рис. 3.4. Хромосомы Drosophila melanogaster. Хромосомы первой пары имеют одинаковую морфологию у самок и разную -у самцов: Х-хромосомы - телоцентрические, Y-хромосомаакроцентрическая ; вторая и третья хромосомы - метацентрики; четвертая хромосома очень мала.

Наследование, сцепленное с полом

Как и многие другие великие научные свершения, открытия Моргана и Бриджеса были сделаны в процессе анализа отклонений от ожидаемых результатов. Морган использовал для своих опытов линию D.melanogaster с белыми, а не с обычными красными глазами. Линия разводилась в чистоте: потомство белоглазых мух также было белоглазым. Однако, когда белоглазых мух скрещивали с красноглазыми, соотношение тех и других в потомстве не согласовывалось с менделевскими законами наследования.

Рис. 3.5. Сцепленное с полом наследование у Drosophila melanogaster. Скрещиваются красноглазая самка и белоглазый самец; символы w⁺ и w обозначают аллели красноглазости и белоглазости соответственно.

Если красноглазыми были самки, а белоглазыми самцы (рис. 3.5), то в F₁ все мухи имели красные глаза, что соответствует гипотезе о доминантности этого признака. При скрещивании между собой мух из F_l, три четверти потомства в F₂ было красноглазым, а одна четверть -белоглазой, т.е. и в этом случае результаты, казалось бы, подтверждают предположение о доминантности признака «красные глаза». Важно, однако, что в F₂ все самки были красноглазыми, тогда как среди самцов половина имела красные глаза, а половина -белые. Это не совпадало с предсказаниями, следующими из менделевских законов наследственности. Неожиданными оказались и результаты скрещивания между собой мух из F₂. Все самцы разводились в чистоте: красноглазые самцы были носителями лишь генов красноглазости, белоглазые - лишь генов белоглазости. Самки из F₂ были двух типов: потомство одних было исключительно красноглазым, тогда как в потомстве других половина самцов имела красные глаза, а половина - белые.

Рис. 3.6. Сцепленное с полом наследование у Drosophila melanogaster. Скрещиваются белоглазая самка и красноглазый самец. Результаты этого скрещивания отличны от результатов реципрокного скрещивания, представленных на рис. 3.5.

При скрещивании белоглазых самок с красноглазыми самцами результаты были другими (рис. 3.6). Не все потомство от такого скрещивания в fj было красноглазым, как следовало бы ожидать на основе законов Менделя, исходя из доминирования признака «красные глаза». Напротив, лишь половину потомства составляли мухи с такими глазами, тогда как вторая половина имела белые глаза; кроме того, все красноглазые мухи были самками, а белоглазые-самцами. При их скрещивании между собой в F₂ потомство состояло наполовину (а не на четверть!) из белоглазых мух и наполовину из красноглазых, причем в равном числе у обоих полов.

Морган показал, что все эти результаты можно объяснить, если предположить, что, во-первых, ген, определяющий цвет глаз, расположен в половой хромосоме (Х-хромосоме) и, во-вторых, что половая хромосома самцов (Y-хромосома) не содержит этот ген. Как отмечалось в гл. 1, хромосомы образуют пары. Однако хромосомы одной из пар у самок и самцов различны; эти хромосомы связаны с генетическим определением пола. Клетки самок дрозофилы содержат по две Х-хромосомы, а клетки самцов-две разные хромосомы, X и Y (рис. 3.4). Самки получают по одной Х-хромосоме от отца и от матери и передают свои Х-хромосомы как дочерям, так и сыновьям. Самцы же получают Х-хромосому от матери и передают ее лишь дочерям (рис. 3.5 и 3.6). Соответственно признаки, определяемые генами, расположенными в Xхромосоме, наследуются «крест-накрест» : самцы передают эти признаки внукам лишь через дочерей, но не через сыновей.

Морган пришел к заключению, что белый цвет глаз у дрозофилыэто признак, сцепленный с полом; другими словами, ген, определяющий этот признак, расположен в Х-хромосоме. Обнаруженное в этих опытах соответствие между поведением конкретного гена и конкретной хромосомы, хорошо видной на микроскопических препаратах, послужило веским доказательством справедливости хромосомной теории наследственности. Окончательно эта теория была доказана Бриджесом шесть лет спустя.

Нерасхождение Х-хромосом

Как показал Морган, при скрещивании белоглазых самок дрозофилы с красноглазыми самцами дочери оказываются красноглазыми, а сыновья - белоглазыми (рис. 3.6). Однако и из этого правила бывают, оказывается, редкие исключения. Примерно у одной из двух тысяч мух в F₁ от такого скрещивания цвет глаз оказывается противоположным: белым у самок и красным у самцов. Бриджес предположил, что появление редких мух возможно при нерасхождении Х-хромосом; другими словами, в тех случаях, когда Х-хромосомы не расходятся в мейозе к разным полюсам, а направляются вместе к одному из полюсов, в результате чего образуются яйцеклетки с двумя Х-хромосомами и яйцеклетки без Х-хромосом (рис. 3.7).

Рис. 3.7. Первичное нерасхождение Х-хромосом у Drosophila melanogaster. В левой части рисунка для сравнения изображены результаты правильного расхождения.

Если у белоглазой мухи образуется яйцеклетка с двумя Х-хромосомами и эта яйцеклетка оплодотворяется спермием, содержащим Y-xpoмосому, то образовавшаяся зигота имеет две Х-хромосомы и одну Υхромосому, причем обе Х-хромосомы содержат ген белых глаз. Бриджес предположил, что белоглазые самки в потомстве от скрещивания между красноглазыми самцами и белоглазыми самками развиваются именно из таких зигот. Когда же яйцеклетка, не содержащая ни одной Х-хромосомы, оплодотворяется спермием красноглазого самца, несущим Х-хромосому, то в зиготе оказывается одна Х-хромосома, несущая ген красных глаз, а Y-хромосомы нет вовсе. Бриджес предположил, что из таких зигот развиваются красноглазые самцы. Другими словами, гипотеза Бриджеса состояла в том, что появляющиеся с частотой 1 :2000 белоглазые самки получают по две Х-хромосомы от матери (и Y-хромосому от отца), а такие же редкие красноглазые самцы получают лишь одну отцовскую Х-хромосому (и, следовательно, вовсе лишены Y-хромосомы).

Гипотеза Бриджеса была умозрительной, но допускала экспериментальную проверку путем изучения хромосомных наборов мух, представляющих собой исключение из общего правила. Прямые наблюдения показали, что в клетках «исключительных» белоглазых самок действительно содержится по две Х-хромосомы и по одной Y-хромосоме, а клетки «исключительных» красноглазых самцов имеют по одной Xхромосоме, тогда как Y-хромосома у них отсутствует вовсе. Таким образом, было показано, что конкретный ген вне всяких разумных сомнений локализован в конкретной хромосоме.

Вторичное нерасхождение

Самцы дрозофилы, лишенные Y-хромосомы, внешне нормальны, но стерильны. Самки с двумя Х-хромосомами и одной Y-хромосомой нормальны и плодовиты. Бриджес скрещивал таких самок (ΧΧΥ) с нормальными красноглазыми самцами (ΧΥ). Он обнаружил, что около 4% самок в потомстве от таких скрещиваний имеют белые глаза, а около 4% самцов - красные глаза; остальные 96% потомства составляли красноглазые самки и белоглазые самцы. Бриджес предположил, что эти 4% составляют самки и самцы, возникающие снова в результате нерасхождения Х-хромосом в мейозе у самок. Он назвал такое нерасхождение вторичным, поскольку оно происходит в потомстве самок, появившихся в результате первичного нерасхождения Х-хромосом (и потому обладающих двумя Х-хромосомами и одной Y-хромосомой) (рис. 3.8). Вторичное нерасхождение происходит с частотой около 1 :25, т. е. примерно в 100 раз чаще, чем первичное нерасхождение (1 :2000).

Нерасхождение может быть следствием физического сцепления Xхромосом, в таком случае нерасхождение имеет место в 100% случаев (это явление было открыто в 1922 году Лилиан Морган, женой Томаса Моргана) (рис. 3.9). Желтый цвет тела у Drosophila melanogaster определяется сцепленным с полом аллелем yellow (у), рецессивным по отношению к аллелю дикого типа (у ⁺ ). Цвет тела у дрозофил, гомозиготных по этому аллелю, много светлее нормального. Морган обнаружила существование желтых самок, которые при скрещивании с нормальными самцами давали в потомстве лишь желтых дочерей и нормальных сыновей, а не нормальных дочерей и желтых сыновей, как подавляющее большинство. Желтые самки сохраняли эту особенность своих матерей: их потомство также составляли лишь желтые дочери и нормальные сыновья. Цитологический анализ показал, что клетки таких самок содержат по две Х-хромосомы, соединенных одной центромерой, и по одной Y-хромосоме.

Рис. 3.8. Вторичное нерасхождение Х-хромосом Drosophila melanogaster. Бриджес предположил, что мейоз у самок с двумя Х-хромосомами и одной Y-хромосомой происходит двояко: в первом случае Х-хромосомы расходятся к разным полюсам и к одному из них отходит также Y-хромосома (92%), во втором случае обе Х-хромосомы отходят к одному полюсу, а Y-хромосома -к другому; это происходит в 8% случаев, но только половина зигот, образовавшихся при участии таких гамет, способна к нормальному развитию, так что число соответствующих «исключительных» мух составляет около 4%. Свою гипотезу Бриджес подтвердил прямыми наблюдениями хромосомных препаратов различных типов мух.

Рис. 3.9. Нерасхождение Х-хромосом вследствие их сцепленности. Х-хромосомы изображены цветными, Y-хромосомы - белыми. У желтых самок с такой двойной Х-хромосомой яйцеклетки бывают только двух типов, поскольку сцепление Х-хромосом сохраняется во время мейоза, и в результате они вместе отходят к одному из полюсов. При оплодотворении спермиями с Х-хромосомой эти яйцеклетки дают зиготы с тремя Х-хромосомами, которые обычно погибают, и зиготы с одной Х- и одной Y-хромосомой, как у обычных самцов. Когда те же два типа яйцеклеток оплодотворяются спермиями с Yхромосомой, то возникают зиготы с двумя сцепленными Х-хромосомами и одной Y-хромосомой и нежизнеспособные зиготы с двумя Y-хромосомами и не имеющие ни одной Х-хромосомы.

Нерасхождение хромосом встречается не только у дрозофил, но и у других видов. У человека, например (см. гл. 21), нерасхождение в мейозе хромосом двадцать первой пары приводит к рождению детей, клетки которых содержат по три 21-х хромосомы. Это влечет за собой различные отклонения от нормального развития, называемые синдромом Дауна. Нерасхождение половых хромосом у человека приводит к нарушениям развития, называемым синдромом Клайнфельтера. Клетки таких людей содержат по две Х-хромосомы и по одной Y-хромосоме. Нерасхождения хромосом случаются также и в митозе.

Сцепленное с полом наследование у человека и других видов

Механизм сцепленного с полом наследования, описанный выше для дрозофилы, характерен также для всех животных и растений, у которых мужской пол является гетерогаметным. Самцы называются гемизиготными по генам, расположенным в Х-хромосоме, поскольку в отношении этих генов они не являются ни гомо-, ни гетерозиготными. У человека известно около 150 признаков, сцепленных с полом. Характер наследования одной из форм дальтонизма -от матери к ее сыновьям - известен уже сотни лет. В 1911 году Эдмунд Вильсон указал на то, что все известные факты наследования дальтонизма можно объяснить, предположив, что дальтонизм определяется рецессивным сцепленным с полом аллелем, а мужской пол у людей гетерогаметен (рис. 3.10).

Рис. 3.10. Наследование одной из форм дальтонизма у людей. Все сыновья женщины-дальтоника -дальтоники, все ее дочери-носители (гетерозиготы) гена дальтонизма. Мужчина-дальтоник передает ген дальтонизма всем своим дочерям, и через них он наследуется половиной сыновей. (Цвет глаз при этом, конечно, не играет роли; на рисунке неокрашенность радужной оболочки означает дальтонизм.)

Рис. 3.11. Наследование гемофилии в потомстве королевы Виктории. Как это принято при построении родословных у человека, женщины изображены кружками, мужчины - квадратиками. Горизонтальные линии между квадратом и кружком означают супружество, вертикальные линии проведены к потомству.

Рис. 3.12. Сцепленное с полом наследование у кур; скрещивание рябой курицы с гладким петухом. Ген рябой окраски (В) доминантен по отношению к гладкой окраске (b). У кур самки гетерогаметны, следовательно, куры передают Х-хромосому только сыновьям, а дочери получают Х-хромосому от отца. В результате дочери имеют рецессивный фенотип, унаследованный от отца, а сыновья — доминантный фенотип матери. Этот тип наследования отличается от изображенного на рис. 3.5, при котором доминантный фенотип матери наследуется всеми сыновьями и дочерьми.

Другим примером сцепленного с полом признака у человека может служить гемофилия - тяжелое заболевание, для которого характерна неспособность крови свертываться. У нормальных людей при небольшом повреждении тканей кровотечение довольно быстро останавливается вследствие образования сгустков крови. Существуют по меньшей мере три типа гемофилии, два из которых обусловлены рецессивными сцепленными с полом генами, а один -очень редкий - определяется рецессивным аутосомным геном. Каждый из этих генов имеет отношение к одному из факторов, необходимых для нормального свертывания крови. Знаменитый пример сцепленного с полом наследования гемофилии представляет собой родословное древо некоторых правящих династий Европы, восходящее к королеве Виктории (рис. 3.11). Поскольку среди ее предков случаи гемофилии неизвестны, то естественно предположить, что аллель, ответственный за гемофилию, возник в результате мутации в гамете одного из ее родителей.

Рис. 3.13. Сцепленное с полом наследование у кур: скрещивание гладкой курицы с рябым петухом. Все сыновья и дочери наследуют доминантный фенотип отца. Характер наследования отличается от изображенного на рис. 3.6, при котором доминантный фенотип отца проявлялся только у дочерей.

Характер наследования сцепленных с полом признаков, описанный для дрозофилы и человека, меняется на противоположный, когда гетерогаметным полом являются самки. Например, у птиц, бабочек и некоторых рыб именно самки гемизиготны по сцепленным с полом признакам, и они передают гены, определяющие такие признаки, только своим сыновьям, тогда как самцы передают соответствующие гены как сыновьям, так и дочерям (рис. 3.12 и 3.13).

Y-хромосома

Обсуждавшиеся до сих пор гены, сцепленные с полом, расположены в Х-хромосоме и не имеют гомологичных аллелей в Y-хромосоме. Поэтому самцы (точнее, гетерогаметный пол) гемизиготны по сцепленным с полом генам, и эти гены всегда проявляются в их фенотипе, даже если они рецессивны.

Содержатся ли вообще какие-то гены в Y-хромосоме? Большинство генов, имеющихся в Х-хромосоме, в Y-хромосоме отсутствует, однако определенную генетическую информацию она все-таки несет. Различают два типа такой информации: во-первых, содержащуюся в генах, присутствующих только в Y-хромосоме, и, во-вторых, в генах, присутствующих как в Y-, так и в Х-хромосоме.

У видов, самцы которых гетерогаметны, Y-хромосома передается от отца всем его сыновьям, и только им. Следовательно, для генов, содержащихся только в Y-хромосоме, характерно голандрическое наследование, т.е. они передаются только от отца к сыну и проявляются у самцов.

У человека наличие Y-хромосомы-необходимое условие принадлежности к мужскому полу: организмы, обладающие одной Х-хромосомой в отсутствие Y-хромосомы, характеризуются женским фенотипом, хотя большинство из них стерильны (этот генотип определяет так называемый синдром Тернера; см. гл. 21). Вообще, по-видимому, присутствие Y-хромосомы необходимо у животных для возникновения мужских половых признаков (или женских, если гетерогаметным полом являются самки) или, во всяком случае, для плодовитости. У D. melanogaster особи с одной Х-хромосомой в отсутствие Y-хромосомы фенотипически выглядят как самцы, однако они стерильны: содержащиеся в Y-хромосоме гены необходимы для сперматогенеза.

У D. melanogaster известны гены, представленные как в Y-, так и в Х-хромосоме. Носители рецессивной мутации bobbed(bb) в гомозиготном состоянии характеризуются более короткими и тонкими щетинками, чем мухи дикого типа. Ген расположен в ядрышковом организаторе, т.е. в участке хромосом, ответственном за формирование ядрышка в интерфазе клеточного деления. При скрещивании самок, гомозиготных по рецессивному аллелю, с гетерозиготными самцами наблюдается необычное расщепление. Если носителем доминантного аллеля служит Х-хромосома самца, то все самки в F₁ нормальны, а самцы обладают мутантным фенотипом (Х^bbY^bb). Если же носителем доминантного аллеля является Y-хромосома гетерозиготного отца (X^bbY^bb ⁺ ) то в потомстве F₁, напротив, все самки имеют мутантный фенотип (Х^bbХ^bb), а самцы-нормальный (X^bbY^bb ⁺).

У человека в Y-хромосоме содержатся по крайней мере три гена, один из которых необходим для дифференциации семенников, второй требуется для проявления антигена гистосовместимости, а третий оказывает влияние на размер зубов.

Определение пола

Принадлежность к определенному полу - важная особенность фенотипа особи. При чтении этой главы становится все более ясно, что самки и самцы обладают различной хромосомной конституцией. В этом разделе мы рассмотрим более основательно роль, которую хромосомы играют в определении пола.

Таблица 3.1. Определение пола у Drosophila melanogaster
Число Х-хромосом	Число наборов аутосом (А)	Х/А	Фенотипический пол
3	2	1,5	Метасамка*⁾
2	2	1	Нормальная самка
2	3	0,67	Интерсекс
1	2	0,5	Нормальный самец
1	3	0,33	Метасамец*⁾
*⁾ Иногда их называют «суперсамка» и «суперсамец». Мухи с такими генотипами очень ослаблены и часто не доживают до стадии половозрелости.

У человека, так же как у дрозофилы, клетки женских особей содержат по две Х-хромосомы, а мужских - одну Х- и одну Y-хромосому. Такое же различие между полами характерно для большинства позвоночных, многих насекомых и других беспозвоночных, а также для многих двудомных растений (т.е. растений, у которых существуют мужские и женские экземпляры). Однако генетические основы определения пола у всех этих организмов неодинаковы.

У D. melanogaster носители единственной Х-хромосомы, не имеющие Y-хромосомы, обладают нормальным мужским фенотипом (правда, при этом стерильны). Фенотип по полу D. melanogaster определяется соотношением между числом Х-хромосом и числом наборов аутосом (А). Если отношение Х/А = 1, муха имеет фенотип самки, если Х/А = 1/2-фенотип самца, если Х/А больше 1/2, но меньше единицы, то развивается особь с фенотипом, промежуточным между мужским и женским, т.е. «интерсекс» (табл. 3.1). Механизм, посредством которого отношение числа Х-хромосом к числу наборов аутосом определяет развитие того или иного фенотипа, не вполне понятен. Кроме того, у D. melanogaster известны конкретные гены, влияющие на определение пола. Мутантный ген tra (трансформатор) в гомозиготном состоянии придает особям с двумя Х-хромосомами, т.е. «генетическим» самкам, фенотипический облик самцов (которые, однако, стерильны).

В отношении механизмов определения пола человек отличается от дрозофилы тем, что для формирования нормального мужского фенотипа необходимо присутствие Y-хромосомы. Механизмы определения пола у дрозофил и млекопитающих обсуждаются в гл. 17.

У птиц и бабочек самцы являются гомогаметным полом, а самки — гетерогаметным (типа XY или ХО). Половые хромосомы у этих видов иногда обозначают буквами Z и W, выделяя таким образом данный способ определения пола, при этом самцы обозначаются символом ZZ, а самки-ZW или ZO (рис. 3.14).

Совершенно другой механизм определения пола, называемый гаплодиплоидией, широко распространен у пчел и муравьев. У этих организмов нет половых хромосом: самки — это диплоидные особи, а самцы (трутни) - гаплоидные. Самки развиваются из оплодотворенных яиц, а из неоплодотворенных развиваются трутни. У трутней, таким образом, нет отцов, хотя у них и есть деды по материнской линии. В процессе сперматогенеза у трутней не происходит редукции числа хромосом. Из оплодотворенной яйцеклетки может развиться либо «матка» - крупная, способная к размножению самка, либо стерильная рабочая самка. Это зависит от условий выкармливания личинки рабочими особями.

Рис. 3.14. Четыре типа определения пола.

Рис. 3.15. За определение пола у растения Есballium elaterium из семейства тыквенных ответственны три аллеля одного локуса: а^Dобусловливает мужской пол, a⁺ - гермафродитизм, а^d- женский пол. Аллель a^D доминантен по отношению к а⁺ и a^d, аллель а⁺ доминантен по отношению к a^d.

Большинство растений и некоторые животные гермафродитны, т. е в одной особи сочетаются свойства обоих полов. Большинство гермафродитов размножаются путем самооплодотворения (самоопыления) хотя у некоторых животных и отдельных видов растений строение половых органов допускает перекрестное оплодотворение.

Некоторые растения могут быть как однодомными (гермафродитными), так и двудомными. Фернандо Галан показал, что у Ecballium elaterium, растения из семейства тыквенных, система определения пола включает серию из трех аллелей, а^D, а⁺ и a^d, причем а^D доминирует над остальными двумя аллелями, a a⁺ доминантен по отношению к a^d. Аллель a^D определяет мужской пол, а⁺ - гермафродитизм и a^d - женский пол. Соотношение между пятью возможными генотипами и фенотипическим проявлением пола представлено на рис. 3.15. (Гомозигот a^Da^D не существует, поскольку они могли бы возникнуть лишь в результате скрещивания между двумя самцами.)

Наконец, у некоторых животных определение пола зависит от внешних условий. У морского червя Вопеlliа особи, которые в личиночной стадии остаются свободно плавающими, становятся самками, а личинки, прикрепившиеся к телу взрослой самки, превращаются в самцов в результате маскулинизирующего действия гормона, выделяемого самкой. Обитающие в коралловых рифах рыбы Labroides dimidiatus живут стайками, включающими нескольких самок и одного самца. Когда самец погибает, то доминирующая в группе самка начинает отгонять приближающихся к группе самцов и, если это ей удается, начинает ухаживать за самками и вести себя как самец во всех остальных отношениях; примерно через две недели она (теперь уже он) начинает продуцировать способную к оплодотворению икры сперму. Механизм определения пола у Вопеlliа и Labroides экономичен в том смысле, что необходимость размножения не создает тем не менее избытка самцов.

Отношение полов

Численным отношением полов или просто отношением полов называется частное от деления числа самцов на число самок. Эта величина у большинства раздельнополых организмов близка к единице, что является прямым результатом хромосомного механизма определения пола (рис. 3.16). Самки (точнее, гомогаметный пол) продуцируют гаметы одного типа, X, самцы - двух типов, X и Y, причем в равном количестве. В результате зиготы XX и XY также образуются в одинаковом количестве.

Рис. 3.16. Хромосомный механизм определения отношения численности полов. Количество самок и самцов приблизительно одинаково у тех организмов, у которых один пол гомогаметный, а другой - гетерогаметный. Гомогаметные особи продуцируют в отношении половых хромосом только один тип гамет, а гетерогаметные - два типа гамет в равном количестве.

У пчел и родственных им насекомых отношение полов определяется долей оплодотворенных яиц; не удивительно, что оно не равно единице, а обычно много меньше. У тех видов, у которых пол определяется внешними условиями, отношение полов обычно отлично от единицы, причем часто, как, например, у L. dimidiatus, бывает значительно меньшим единицы.

На отношение полов могут влиять некоторые гены. Например, рецессивные летальные гены (т.е. гены, приводящие к гибели организма до достижения половозрелости) в Х-хромосоме дрозофил убивают гемизиготных самцов, но оставляют невредимыми гомозиготных самок. У Drosophila pseudoobscura существует линия, в которой потомство состоит почти исключительно из самок, вероятно, вследствие того, что содержащие Y-хромосому гаметы самцов либо не возникают вовсе, либо не способны оплодотворять яйцеклетки.

Литература

Bridges C.B. (1916). Nondisjunction as proof of the chromosome theory of heredity, Genetics, 1, 1-52, 107-163.

Bridges C.B. (1925). Sex in relation to chromosomes and genes, Amer. Nat., 59, 127-137.

Galan F. (1964). Teoria genética del sexo zigotico en el caso de Ecballium elaterium, Revista de Biologia, 4, 187-220.

Miller O.J., Siniscalco M. (1982). Report of the Committee on the Genetic Constitution of the X and Y Chromosome, Cytogenet. Cell Genet., 32, 179-190.

Morgan L. V. (1922). Non criss-cross inheritance in

Drosophila melanogaster, Biol. Bull., 42, 267-274.

Morgan Т.Н. (1910). Sex-limited inheritance in Drosophila, Science, 32, 120-122.

Morreale S.J., Ruiz G.J., Spotila J.R., Standora E. A. (1982). Temperature-dependent sex determination, Science, 216, 1245-1247.

Sutton W.S. (1903). The chromosomes in heredity, Biol. Bull., 4, 231-251.

Voeller В., 1968. The Chromosome Theory of Inheritance, Appleton-Century-Crofts, New York.

Zulueta A. de (1925). La herencia ligada al sexo en el coleoptero Phytodecta variabilis (Ol.), EOS, Revista Espanola de Entomologia. 1, 203-209.

Ключевые слова и понятия

Гапло-диплоидия

Гемизиготность

Гермафродитизм

Голандрическое наследование

Нерасхождение первичное и вторичное

Половые хромосомы

Сцепленное с полом наследование

Хромосомная теория наследственности

Задачи

3.1. У супругов, зрение каждого из которых нормально, четверо детей: две дочери и два сына. У первой дочери зрение нормальное; у нее есть три сына, два из которых дальтоники. У второй дочери, а также у ее пяти сыновей зрение нормальное. Первый сын дальтоник; у него две дочери и два сына, и все видят нормально. Второй сын и четверо его сыновей также имеют нормальное зрение. Каковы генотипы дедушки с бабушкой, всех их детей, их супругов и внуков?

3.2. Если женщина, отец которой страдал гемофилией, вышла замуж за здорового мужчину, то какова вероятность того, что у ее ребенка будет гемофилия? Предположим теперь, что отец мужа также был болен гемофилией ; какова вероятность в этом случае?

3.3. У дрозофилы ген редуцированных крыльев (vg) рецессивен и расположен в аутосоме; ген желтой окраски тела (у) также рецессивен, но сцеплен с полом. Если гомозиготную по этим генам самку скрестить с нормальным самцом, то как будет выглядеть потомство в F₁ и F₂?

3.4. Предположим, что у желтой самки с редуцированными крыльями из условия предыдущей задачи Х-хромосомы связаны общей центромерой. Какое потомство можно ожидать от скрещивания с нормальным самцом?

3.5. Петух гетерозиготен по сцепленной с полом рецессивной летали. Каково отношение полов в потомстве от скрещивания такого петуха с нормальными курами?

3.6. Иногда у кур яичники не развиваются или не функционируют, а вместо них развиваются семенники. У некоторых из таких «петухов» с переопределенным полом могут быть цыплята. Какого типа потомство можно ожидать от скрещивания таких петухов с нормальными курами? Каково будет отношение полов в потомстве с учетом того, что яйца типа WW не способны к развитию?

3.7. Рябую курицу скрещивали

с гладким петухом. В F₂ проводились все возможные типы скрещиваний. Каково будет потомство в F₃?

3.8. Какие типы потомства и в каком отношении возникают при скрещивании гладкой курицы с гетерозиготным рябым петухом?

3.9. У Ecballium elaterium однодомные (гермафродитные) растения классифицируют как вариант elaterium, а двудомные (мужские и женские) - как вариант dioicum. Обычно используются следующие генетические обозначения: Е. elaterium elaterium обозначается , мужские растения Е. elaterium dioicum -, женские растения Ε. е. dioicum-. Предположим, что в природе растения обычно имеют генетическую конституцию дикого типа. Каковы будут результаты скрещиваний: a) dioicum x dioicum ; б) elaterium x x elaterium; в) elaterium x dioicum ; г) dioicum x elaterium?

3.10. Предположим, что в потомстве от скрещивания типа в) из условий предыдущей задачи плодовиты любые типы перекрестного опыления. Какие типы растений и в каких пропорциях будут присутствовать в потомстве от всех типов такого скрещивания? Ответьте на тот же вопрос применительно к результатам скрещивания типа г).

3.11. В потомстве от скрещивания двух растений Ecballium elaterium возникают исключительно гермафродитные растения. При их скрещивании в F₂ одну четверть потомства составляют двудомные женские растения и три четверти - однодомные растения. Каковы генотипы представителей всех трех поколений?

3.12. Самка медоносной пчелы Apis mellifera диплоидна, а трутни гаплоидны. Существует, однако, локус со множественными аллелями, влияющий на определение пола у диплоидных особей. Все диплоидные особи, гетерозиготные по этому локусу, - самки, а гомозиготные по любому из аллелей - самцы. Гомози-

готные самцы не достигают половозрелости, поскольку обычно поедаются рабочими пчелами на личиночной стадии в первые трое суток после вылупления из яичек. Таким образом, гомозиготный генотип в естественных условиях детален. Однако изъятых из улья личинок таких самцов можно довести до стадии половозрелости. В этом локусе насчитывается около двадцати аллелей, обозначаемых символами A₁, А₂, , А₂₀. Пусть в потомстве некоторой оплодотворенной гаплоидным трутнем матки лишь половина яичек способна к развитию (это хорошо заметно, поскольку половина ячеек в сотах остается пустой, и пустые ячейки распределены по сотам случайным образом). Что можно сказать о генетической конституции матки и трутня?

3.13. Предположим, что диплоидный трутень оплодотворяет матку, у которой в локусе, определяющем пол, один из аллелей идентичен аллелю трутня. Какой процент потомства будет жизнеспособен в улье?

3,14. Пусть число аллелей в локусе, определяющем пол, равно двадцати. Сколько существует генетически различных типов гаплоидных самцов? Диплоидных самцов? Самок?

3.15. Локализация гена в Y-хромосоме впервые была обнаружена Антонио де Зулуэта в 1925 году. Существуют четыре фенотипических класса жуков-листоедов Phytodecta variabilis: полосатый, желтый, красный и черный, отличающиеся окраской надкрылий. Все четыре фенотипа определяются аллелями одного гена, обозначаемыми е^l для полосатых жуков, е^у для желтых жуков, е^r для красных и е^bдля черных. Характер доминирования среди этих аллелей можно описать неравенством е^b > е^r > е^y > е^l, где знак « > » означает «доминантен по отношению к». Ген расположен в половых хромосомах, причем все четыре аллеля могут быть локализованы как в Х-, так и в Y-хромосоме. Зулуэта обнаружил, что полосатый фенотип очень редко встречается у самцов (0,5% всех самцов) и широко распро-

странен у самок (59% всех самок). Как вы можете объяснить этот факт?

3.16. При скрещивании полосатой самки Phytodecta variabilis с желтым самцом в f₁ обнаружено 13 полосатых самок и 11 желтых самцов. В F₂ все самки (31) были полосатыми, а все самцы (29) -желтыми. Каковы генотипы родителей и потомства в F₁ и F₂? Используйте метод хи-квадрат для проверки вашей гипотезы.

3.17. Допустим, что вам неизвестен пол особей в поколениях F₁ и F₂ из скрещивания, описанного в предыдущей задаче. Могли бы такие результаты получиться, если бы ген окраски надкрылий не был сцеплен с полом? Используйте метод хиквадрат для проверки гипотезы о несцепленности с полом данного гена уже с учетом половой принадлежности особей.

3.18. При скрещивании красной самки Phytodecta variabilis с красным самцом в потомстве оказалось 15 желтых самок, 15 красных самок и 34 красных самца. При скрещивании отдельных желтых самок из поколения F₁ с отдельными красными самцами из того же поколения соотношение фенотипов в потомстве оказалось в разных скрещиваниях различным: примерно в половине скрещиваний все самцы и самки в потомстве были красными, в другой половине самцы имели красную окраску, а самки примерно в равном числе были .желтыми и полосатыми. Каковы вероятные генотипы родителей?

3.19. У некоторых тропических рыб, таких как меченосцы и гуппии, в некоторых линиях гетерогаметными бывают самцы, а в других - самки. В диких линиях самки часто бывают типа XX, самцы типа XY; в некоторых аквариумных линиях самки имеют генотип ZW, самцы - ZZ. При перекрестных скрещиваниях можно получить самцов с комбинациями половых хромосом типа ZZ, XZ, XY или YY, а самок с комбинациями XX, XW, ZW или YW. Каково будет отношение полов в следующих типах скрещиваний: а)XX xΖΖ; б)ZW xΧΖ; в)XW xΧΖ?

4. Природа генетического материала

Связь между менделевскими генами и хромосомами клетки была твердо доказана Бриджесом в 1916 году (гл. 3). Ему удалось установить, что все гены имеют некоторые общие свойства. Во-первых, они способны создавать собственные копии (самореплицироваться) во время удвоения хромосом в период, предшествующий мейозу. Во-вторых, в результате мутаций гены могут переходить в различные аллельные формы, что также предполагает способность к саморепликации. Редкость мутаций указывает на то, что гены представляют собой очень стабильные структуры, способные к точной дупликации. В-третьих, гены различными способами оказывают влияние на фенотип. Проявление альтернативных признаков, как впервые заметил Мендель (длинный или короткий стебель, гладкие или морщинистые семена и т. п.), служит основным критерием идентификации генов при наблюдениях над расщеплением аллелей в потомстве различающихся по данному признаку родителей. Устойчивая передача признаков из поколения в поколение, нарушаемая лишь мутациями, ставит перед нами вопросы: как определяются такие признаки? Что представляет собой образующее ген вещество, способное к саморепликации, мутациям и фенотипическому проявлению?

Ответы на такие фундаментальные вопросы неизбежно очень сложны, когда вопросы формулируются применительно к росту, развитию и размножению высших организмов, например человека, или даже менее сложных организмов, таких как мухи или растения гороха. Чем проще устроен организм, тем больше он подходит для решения подобных вопросов. Первые сведения о физических и химических основах наследственности были получены при работе с микроорганизмами.

Бактерии, ранее изучавшиеся лишь постольку, поскольку они являются возбудителями болезней человека и домашних животных, оказались удобным объектом для исследования наследственности и природы генетического материала. Вирусы, устроенные проще, чем бактерии, оказались и более удобным объектом. Вирусы способны размножаться лишь внутри живых клеток. Бактериофаги проникают в бактериальные клетки; другие вирусы поражают клетки растений и животных, и многие из них патогенны.

Еще в 1922 г. генетик Мёллер отметил два важных общих свойства бактериофагов и генов: и те и другие способны к размножению, создавая точные копии самих себя; и те и другие в результате мутаций могут принимать новые формы. Мёллер писал¹⁾:

«С другой стороны, если тельца Д'Эрелля (бактериофаги) действительно представляют собой гены, в основных чертах сходные с генами хромосом, то это дает нам возможность подступиться к проблеме гена с совершенно новых позиций... Было бы слишком опрометчиво назвать эти тельца генами, однако мы должны признать, что какие-либо отличия между генами и ими нам не известны. Следовательно, мы не можем категорически отвергать возможность того, что когда-нибудь мы научимся растирать гены в ступке, а затем снова собирать их в пробирке. Должны ли генетики превратиться в бактериологов, химиков и физиков, одновременно оставаясь при этом зоологами и ботаниками? Хотелось бы надеяться».

В 1922 г. генетики считали, что менделевские гены могут находиться лишь в ядрах клеток. Бактериофаги явно много мельче бактериальных клеток. Не могут ли они представлять собой «высвободившиеся» гены, способные к размножению, лишь попадая в бактериальную клетку? Эта гипотеза стимулировала множество исследований бактериофагов и других вирусов, исследований, частично подтвердивших идею Мёллера.

В этой главе мы рассмотрим, как изучение бактерий и вирусов привело к пониманию химической природы генетического материала и как были определены его физическая структура и свойства. В последующих главах мы проанализируем, какой вклад внесло изучение микроорганизмов в наши представления об организации и механизмах проявления генетического материала.

Бактерии как экспериментальный объект

Наиболее интенсивно исследуемый вид бактерий-это обитатель кишечника человека Escherichia coli Эта бактерия легко выращивается в жидкой среде, содержащей некоторые соли (NaCl, NH₄C1, KH₂PO₄, CaSO₄), ничтожные количества некоторых других необходимых элементов и какой-нибудь простой источник углерода, например глюкозу. Из этих веществ Е. coli способна синтезировать все сложные органические молекулы, образующие клетку (такие бактерии называются прототрофами). В питательной среде всего лишь за один день плотность популяции, возникшей из единственной клетки Е. coli, может достичь 2-3·10⁹ бактерий в миллилитре. Многие другие бактерии, особенно паразитические, не способны сами синтезировать некоторые органические соединения, и потому присутствие соответствующих соединений в среде необходимо для их существования. Такие бактерии называются ауксотрофами.

¹ Muller HI. (1922). American Naturalist, 56, 32.

Рис. 4.1. Для определения количества живых бактериальных клеток в культуре ее образец последовательно разводят и фиксированный объем суспензии из последнего разведения высевают на твердую среду. После инкубации каждая бактериальная клетка, размножаясь, образует видимую невооруженным глазом колонию своих потомков. Подсчитав число колоний на чашке, легко узнать концентрацию бактериальных клеток в исходной культуре. Например, на чашке выросло 100 колоний, следовательно, в 0,1 мл разбавленной культуры содержалось 100 клеток, а их число в исходной пробе равно (100 клеток/0,1 мл)· 10²· 10²· 10² = 10⁹ клеток в 1 мл (Stent G.S., Calendar R. 1978. Molecular Genetics, 2nd éd., W. H. Freeman, San Francisco.) [Имеется перевод: Стент Г.. Кэлиндар Р. 1981. Молекулярная генетика, М., Мир.]

Количество живых клеток в бактериальной культуре можно приблизительно подсчитать, если развести определенным образом культуру и фиксированный объем суспензии высеять в чашку Петри на поверхность твердой питательной среды (с агар-агаром) (рис. 4.1). Если культура разведена достаточно для того, чтобы отдельные клетки оказались на значительном расстоянии друг от друга, то при инкубации чашки Петри в подходящих условиях каждая бактерия начинает быстро делиться и формирует на поверхности агара различимую невооруженным глазом колонию. Количество таких колоний можно подсчитать и, умножив полученную величину на коэффициент разведения, определить число клеток в исходной культуре (см. рис. 4.1). Этот способ дает возможность изучать потомство любой отдельной клетки. Например, можно получить чистую культуру любой мутантной бактерии, присутствовавшей в исходной суспензии клеток путем ее разведения и посева в чашке Петри. Этот простой метод лежит в основе всех исследований по генетике бактерий и использовался во всех обсуждаемых ниже экспериментах.

Результаты, полученные на бактериях, внесли значительный вклад в наше понимание механизмов наследственности. В начальный период развития генетики исследования велись главным образом на высших организмах, размножающихся, так же как и человек, половым путем. У бактерий некоторые формы полового процесса были обнаружены лишь в 1946 году. Только постепенно ученые осознали, что механизмы наследования признаков у человека и бактерий в основах своих имеют очень много общего.

Экспериментальные исследования бактериофагов

Исследования, проведенные на фагах, внесли неоценимый вклад в наше понимание механизмов наследственности. Заражая бактериальные культуры, легко получить колоссальные популяции фагов - до 10¹¹ частиц в 1 мл и более.

Титр фагов в культуре определяется следующим образом. Суспензия фаговых частиц соответствующим образом разводится, смешивается с определенным объемом культуры живых бактериальных клеток в полужидком агаре, а затем эта смесь равномерно распределяется по поверхности твердой питательной среды в чашке Петри и затвердевает. После инкубации живые бактерии, размножаясь, образуют плотный и видимый невооруженным глазом сплошной слой клеток (газон). В тех же местах, которые инфицированы фаговыми частицами, образуются негативные колонии (или бляшки) (рис. 4.2). Пробы, взятые из этих бляшек, способны заражать бактерии в других чашках потомством исходного фага. Если фаговых частиц в бактериальной культуре относительно мало, то каждая негативная колония на бактериальном газоне содержит потомство одной индивидуальной частицы фага. Концентрацию (титр) фага в исходной культуре можно определить, подсчитав число бляшек на газоне и умножив его на коэффициент разведения, как это показано на рис. 4.2. Заражая свежую культуру бактерий материалом из одной негативной колонии, можно получить чистый препарат фага.

Рис. 4.2. Для определения количества жизнеспособных фаговых частиц образец препарата последовательно разводят и фиксированный объем разбавленной фаговой культуры смешивают с определенным объемом полужидкого питательного агара, содержащего несколько капель свежей бактериальной культуры (примерно 10⁸ клеток). Затем полужидкий агар, смешанный с бактериями и фагами, выливают на поверхность твердой среды в чашку Петри, где он и застывает. После инкубации бактерии образуют на поверхности чашки плотный газон. В тех местах, где заражение фагом вызвало лизис бактерий, в газоне образуются «дырки». Число «дырок», или бляшек, отражает число частиц фага, попавших в полужидкий агар. Если на поверхности чашки насчитывается 100 бляшек, значит, в 0,1 мл разбавленной культуры содержалось 100 фаговых частиц. Число фагов в исходной культуре, следовательно, было равно (100 фагов/0,1 мл)·10²·10²·10²·10²= 10¹¹ фагов в 1 мл. (StentG.S., Calendar R. 1978. Molecular Genetics, 2nd éd., W. H. Freeman, San Francisco.) [Имеется перевод: Стент Г., Кэлиндар Р. 1981. Молекулярная генетика, М., Мир.]

ДНК - трансформирующий фактор пневмококка

В наши дни общеизвестно, что дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) - носитель наследственности у всех прокариот и эукариот. Впервые это было показано в исследованиях на бактериях пневмококках. Некоторые линии (штаммы) этого микроорганизма вызывают воспаление легких у млекопитающих. Бактерии патогенных штаммов синтезируют полисахаридную капсулу, слизистая поверхность которой защищает бактериальную клетку от фагоцитов иммунной системы зараженного животного. Штаммы пневмококков можно отличить друг от друга по антителам, продуцируемым животными в ответ на попадание в их организм различных полисахаридов и белков соответствующей линии бактерий. Именно по антителам на капсулярные полисахариды различают патогенные штаммы; их обозначают как тип I, тип II, тип III и т.д.

Патогенные штаммы, выращиваемые на твердой питательной среде в лаборатории, образуют блестящие гладкие колонии; такую морфологию колонии имеют из-за синтезируемых бактериями слизистых оболочек. Иногда возникают мутантные клетки, утратившие способность к ферментативной активности, необходимой для синтеза слизистой оболочки. Эти мутантные клетки образуют колонии с шероховатой поверхностью; они в отличие от родительских клеток S обозначаются буквой R (рис. 4.3). R-штаммы размножаются так же успешно, как и штаммы S, причем иногда происходят обратные мутации, восстанавливающие способность к синтезу слизистой оболочки. Тип капсулярных полисахаридов, синтезируемых в ревертантах, всегда совпадает с типом полисахаридов исходного родительского штамма: IIS⇆IIR, IIIS ⇆ IIIR и т.д. Следовательно, различные R-штаммы нетождественны: каждый из них соответствует родительскому штамму S.

Рис. 4.3. Колонии пневмококков, растущие на питательной среде. Маленькие колонии принадлежат бактериям типа IIR, а большие блестящие колонии - трансформированному типу IIIS. (Prof. Maclyn McCarty, Rockfeller University.)

Бактерии R-штаммов непатогенны. Когда такие клетки попадают в организм животного, например мыши, то такая мышь обычно переносит заражение, вырабатывая антитела, ведущие к фагоцитозу и гибели бактериальных клеток. Однако мышь, зараженная бактериями S-штамма, неизбежно гибнет от воспаления легких, поскольку эти бактерии покрыты синтезируемой ими слизистой оболочкой. В 1928 г. Фредерик Гриффит показал, что если мыши ввести пневмококки штамма IIR вместе с убитыми нагреванием клетками типа IIIS, то мыши погибают от инфекции, которая, как показывает вскрытие, вызывается клетками типа IIIS. Контрольные эксперименты показали, что порознь ни инъекция клеток IIR, ни инъекция убитых нагреванием клеток IIIS не ведет к гибели мышей. Тот факт, что вызывающие инфекцию клетки синтезировали слизистую оболочку типа III, а не типа II, свидетельствовал о том, что эти клетки не могли возникнуть в результате обратной мутации в клетках штамма IIR (IIR ⇆ IIS). Гриффит пришел к заключению, что непатогенные клетки штамма IIR могут трансформироваться в патогенные убитыми нагреванием клетками штамма IIIS. Оказалось, что слишком высокая температура разрушает трансформирующий фактор, а слишком низкая температура не нарушает активность фермента, разрушающего трансформирующий фактор, и, следовательно, тоже подавляет трансформацию. Было показано, что при температуре 65°С уже прекращается ферментативная активность, но еще сохраняется активность трансформирующего фактора.

Впоследствии другие исследователи обнаружили, что трансформация непатогенных штаммов пневмококка в патогенные может осуществляться и в лабораторной культуре клеток. Изредка возникающие трансформированные клетки легко отделить от нетрансформированных, поскольку они не агглютинируются сывороткой, содержащей антитела против клеток типа IIR. Агглютинировавшие клетки IIR осаждаются хлопьями на дно культурального сосуда, тогда как трансформированные клетки не слипаются, а свободно размножаются, образуя мутную суспензию клеток IIIS (рис. 4.4). Развитие такого метода выделения трансформированных клеток in vitro («в пробирке») дало важное преимущество, поскольку позволило исследовать природу трансформирующего фактора убитых нагреванием клеток IIIS непосредственно, не вводя их мышам и не дожидаясь гибели последних.

Освальд Эвери, Колин Мак-Леод и Маклин Мак-Карти использовали этот метод для определения вещества, ответственного за трансформирующую активность убитых нагреванием клеток IIIS. Результаты их исследований, опубликованные в 1944 г., показали, что трансформирующим фактором служит дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Когда в растущую культуру клеток IIR добавляли очищенную ДНК пневмококка IIIS, этого оказывалось достаточно для того, чтобы у некоторых клеток типа IIR возникла способность синтезировать капсулярный полисахарид, характерный для клеток типа IIIS. Затем Эвери и его соавторы показали, что трансформирующий фактор может быть разрушен ферментами, расщепляющими ДНК (дезоксирибонуклеазами). Из этих экспериментов также следовало, что клетки типа IIR, полученные в результате вызванной ДНК трансформации из клеток IIIS, могут передавать приобретенную способность к биосинтезу определенного полисахарида своему потомству.

Рис. 4.4. Постановка эксперимента по определению природы трансформирующего агента. Активный фактор, содержащийся в убитых высокой температурой клетках IIIS, может быть выделен в чистом виде при фракционировании содержимого клетки. Оказалось, что трансформирующим фактором является вязкая нативная ДНК пневмококка.

Таким образом, это новое свойство, полученное вместе с ДНК другой линии клеток, становится наследственным свойством трансформированной клетки, как до того оно было наследственным свойством линии, из которой была получена ДНК. Следует подчеркнуть, что химический состав ДНК совершенно отличен от полисахарида, образующего слизистую оболочку, синтезируемую клетками линии IIIS; это означает, что трансформирующий фактор не является полисахаридом, влияющим на фенотипическое проявление слизистой оболочки. Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти впервые показали, что наследственная способность клетки осуществлять определенную биосинтетическую функцию может передаваться другой клетке вместе с очищенной ДНК. Это открытие можно назвать выдающимся. В дальнейших исследованиях механизма трансформации было продемонстрировано, что фрагменты ДНК (в том числе содержащие ген, ответственный за синтез полисахарида) из убитых высокой температурой клеток попадают в R-клетки и посредством рекомбинации включаются в их ДНК (рис. 4.5).

Фундаментальное значение этого открытия, однако, не было вполне оценено сразу по трем причинам. Во-первых, знания о химической структуре ДНК были неполными и неправильно интерпретировались: считалось, что ДНК - соединение, химически недостаточно сложноорганизованное для того, чтобы содержать огромное количество информации, необходимой для управления развитием растений или животных. Во-вторых, многие ученые полагали, что химической основой генов служат белки, относительно которых было известно, что они устроены сложно. Наконец, изучение основ наследственности бактерий в 1944 г. только начиналось, и еще не было четко установлено, что бактерии обладают генами, во всех отношениях аналогичными генам, изучавшимся на высших организмах. Не было твердо установлено, что появление R-клеток и их обратное превращение в S-клетки происходит в результате мутаций. Может быть, ДНК и является наследственным веществом бактерий, но какое вещество играет ту же роль у высших организмов, для которых известно существование генов?

Рис. 4.5. Трансформация клеток IIR требует проникновения в эти клетки ДНК клеток типа IIIS и включения ДНК в хромосомы клеток IIR. Действие гена проявляется в синтезе клетками IIR полисахаридной оболочки, характерной для клеток типа IIIS. Этот ген передается потомству, составляя часть наследственной информации трансформированных клеток IIR.

Нуклеиновые кислоты - наследственный материал вирусов

Генетические исследования бактериофагов начались много раньше, чем бактерий (отчасти вследствие проницательности Мёллера), и в 1952 г. удалось показать, что наследственным веществом фага Т2 является ДНК. Это открытие было встречено с большим воодушевлением и привлекло внимание к работам, выполненным на пневмококках за несколько лет до этого. Бактериофаг Т2 - один из наиболее тщательно исследованных фагов Е. coli. Этот вирус содержит ДНК, заключенную в белковую оболочку. В 1952 г. Альфред Херши и Марта Чейз выяснили роль каждого из этих двух компонентов в формировании потомства фага.

Лишь белковая составляющая Т2 содержит серу (в составе аминокислот метионина и цистеина). Фаг Т2 размножали на бактериях, культивируемых в среде с радиоактивным изотопом ³⁵S, в результате чего белок фага был помечен этим изотопом. По меньшей мере 99% всего фосфора в фаге Т2 приходится на ДНК, ее пометили радиоактивным изотопом ³²Р. Эти радиоактивные метки позволяли проследить пути белка и ДНК фага Т2 при инфекции.

Инфекционный процесс начинается с прикрепления фага к бактериальной клетке (рис. 4.6). Этот этап можно наблюдать в электронный микроскоп; результаты наблюдений подтверждаются тем, что при центрифугировании клеток на данной стадии инфекции фаги, содержащие как ³⁵S, так и ³²Р, осаждаются вместе с бактериями. Херши и Чейз обнаружили, что вскоре после инфицирования большую часть меченного ³⁵S белка можно отделить от бактериальных клеток, активно перемешивая и встряхивая культуру на мешалке ; однако большая часть меченной ³²Р ДНК не отделяется при этом от бактериальных клеток, поскольку, вероятно, оказывается в этом время уже внутри их. Устранение из культуры пустых белковых оболочек фага, так называемых «теней», не влияет на дальнейшие события: бактерии лизируются, и из них выходит потомство фага точно так же, как в том случае, когда тени остаются прикрепленными к клеткам (рис. 4.6). Из этого опыта Херши и Чейз сделали вывод, что для образования копий фага в зараженной бактериальной клетке существенна лишь ДНК родительского фага, хотя сами копии содержат как ДНК, так и белок. Таким образом, было высказано предположение, что белковый компонент фага лишь защищает ДНК от расщепляющих ферментов и обеспечивает попадание ДНК в бактериальную клетку, тогда как ДНК представляет собой собственно вещество наследственности.

Эксперимент Херши-Чейза свидетельствовал о важной генетической роли ДНК. Существуют две причины, по которым именно этот эксперимент был сразу признан в качестве решающего доказательства генетической роли ДНК, тогда как эксперименты Эвери, Мак-Леода и МакКарти по трансформации пневмококков не обратили на себя такого внимания. Во-первых, эксперимент был поставлен на бактериофаге, относительно которого было хорошо известно, что по характеру наследования признаков он аналогичен высшим организмам; на фаге Т2 было продемонстрировано существование мутаций и, так же как у высших организмов, описана рекомбинация мутантных генов. Во-вторых, проводившиеся между 1944 и 1952 годами химические исследования состава ДНК многих различных организмов опровергли широко распространенное ранее представление о ДНК как о простом полимере, в котором один тетрануклеотид многократно повторяется во всех молекулах. Эти исследования обнаружили, что ДНК обладает достаточной химической сложностью, чтобы служить веществом наследственности.

Опыты, проведенные на вирусе табачной мозаики (ВТМ), прямо показали, что белки вируса не играют генетической роли при заражении растений. Это послужило дополнительным аргументом в пользу того, что наследственным веществом вирусов служит нуклеиновая кислота, а не белковая составляющая. Подобно большинству вирусов растений, ВТМ (см. рис. 1.1) состоит из белка и рибонуклеиновой кислоты (РНК). РНК по химической структуре близка к ДНК, как мы увидим в следующем разделе. Каждая частица вируса содержит молекулу РНК, состоящую примерно из 6400 нуклеотидов, заключенную в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из примерно 2130 одинаковых субъединиц, каждая из которых представляет собой полипептидную цепь из 158 аминокислот, расположенных в определенной последовательности.

Рис. 4.6. А. Схема опыта ХершиЧейза, показавшего, что компонентом, ответственным за образование потомства фага Т2 в зараженной фагом клетке, является ДНК фага. Б. Судьбу ДНК фага Т2 можно проследить, измеряя радиоактивность. Изотоп фосфора ³²Р, который служит меткой ДНК, остается связанным с зараженной клеткой, тогда как белок фага, меченный радиоактивной серой ³⁵S, может быть удален с поверхности инфицированной клетки; при этом инфекционный процесс не прервется.

Рис. 4.7. Разделение (деградация) частиц вируса табачной мозаики на РНК и белковые субъединицы. Из РНК одного штамма и белковых субъединиц другого могут быть сконструированы гибридные вирусные частицы. При заражении растительных клеток гибридным фагом РНК и белок потомства гибридного фага полностью определяются его РНК. Особенности белка гибридного ВТМ не наследуются его потомством.

Существуют химические методы, позволяющие разделить РНК и белок вируса (рис. 4.7). Обычно очищенный препарат РНК ВТМ сохраняет не более 0,1% инфицирующей активности препарата интактного (неповрежденного) вируса. Однако при надлежащих условиях вирус можно в лабораторных условиях реконструировать из смеси очищенного белка. Субъединицы белка соединяются друг с другом и с РНК, образуя интактный вирус с нормальной способностью к инфекции.

Известно множество разновидностей ВТМ, отличающихся по кругу растений-хозяев и по вирулентности на различных растениях. Между ними существуют заметные различия и в аминокислотном составе белков. Например, в белковой оболочке ВТМ стандартного штамма отсутствуют гистидин и метионин, тогда как в вирусах штамма HR эти аминокислоты содержатся. Были проделаны эксперименты по реконструкции гибридных вирусов из очищенного белка HR и очищенной РНК стандартного штамма. Такие вирусы обладали нормальной инфекционностью. Когда же этими вирусами заражали растения, то состав белковой оболочки потомства гибридных вирусов совпадал с составом белков штамма, из которого была взята РНК. Состав белковой оболочки гибридного вируса не наследовался; потомство таких вирусов имело белковые оболочки, состав которых определялся исключительно РНК. Оказалось, что лишь РНК обладает функциями, необходимыми для наследственной передачи этого признака (рис. 4.7).

Неопровержимым доказательством того, что носителем наследственных свойств вирусов служат именно нуклеиновые кислоты, можно считать демонстрацию инфекционных свойств очищенной нуклеиновой кислоты. Как уже указывалось, очищенная РНК ВТМ обладает слабой инфекционностью. Этот факт сначала объясняли тем, что в составе очищенного препарата РНК могло сохраниться некоторое количество интактных вирусов. Однако дальнейшие исследования показали, что инфекционность препаратов РНК ВТМ разрушается в результате обработки очищенным ферментом поджелудочной железы млекопитающих, называемым рибонуклеазой. Этот фермент гидролизует незащищенную РНК, но не влияет на инфекционность интактных частиц ВТМ. Пониженная способность к инфекции препаратов РНК ВТМ по сравнению с интактными вирусами объясняется отсутствием белковой оболочки, защищающей РНК от гидролиза. Рибонуклеазы растения разрушают большую часть РНК до того, как они проникают в клетку. Однако тщательные исследования показали, что одна-единственная молекула РНК интактного вируса способна заразить растительную клетку и привести к образованию полноценных частиц ВТМ.

Впоследствии было показано, что очищенная ДНК некоторых фагов, из которых наиболее известны фХ174 и λ, может заражать бактерии и в отсутствие белковой оболочки. Свободным молекулам ДНК нелегко проникнуть через клеточную стенку. Однако, обрабатывая бактерии Е. coli определенным ферментом, а именно лизоцимом яичного белка, можно сделать их клеточную стенку проницаемой. Бактериальные клетки, стенки которых обработаны таким способом, называются сферопластами (из-за сферической формы, которую приобретают бактерии в результате такой обработки). Сферопласты не Способны к нормальному росту, однако они могут быть инфицированы молекулами ДНК, выделенной из фагов фХ174 и λ, и производить полноценные фаговые частицы. Такие эксперименты показывают, что именно ДНК, а не белок является наследственным материалом бактериофагов.

Таким образом, уже в результате первых исследований стало ясно, что именно нуклеиновые кислоты являются носителем наследственности во всех организмах. Два типа нуклеиновых кислот-ДНК и РНК-выполняют генетические функции во всех прокариотических и эукариотических клетках. Однако вирусы содержат лишь тот или иной тип нуклеиновых кислот.

Химический состав и строение нуклеиновых кислот

Основная структурная единица нуклеиновых кислот-нуклеотид. Нуклеотид состоит из трех химически различных частей, соединенных ковалентными связями (рис. 4.8). Первая часть - это содержащий пять атомов углерода сахар: дезоксирибоза в ДНК и рибоза в РНК. Вторая часть - пуриновое или пиримидиновое азотистое основание, ковалентно соединенное с первым атомом углерода сахара, оно формирует структуру, называемую нуклеозидом. ДНК содержит пуриновые основанияаденин (А) и гуанин (G)-и пиримидиновые основания-цитозин (С) и тимин (Т); соответствующие нуклеозиды называются дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, дезоксицитидин и дезокситимидин. РНК содержит те же пуриновые основания, что и ДНК, а также пиримидин цитозин, но вместо тимина в ее состав входит урацил (U); соответствующие нуклеозиды называются аденозин, гуанозин, цитидин и уридин. Третью часть нуклеотида составляет фосфатная группа; фосфатные группы соединяют соседние нуклеозиды в полимерную цепочку посредством фосфодиэфирных связей между 5'-атомом углерода одного сахара и 3'-атомом углерода другого (рис. 4.8, Б и В). Нуклеотидами называются нуклеозиды с одной или несколькими фосфатными группами, присоединенными эфирными связями к 3'- или 5'-атомам углерода сахара. Синтез нуклеотидов предшествует синтезу нуклеиновых кислот, и соответственно нуклеотиды являются продуктами химического или ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот.

Нуклеиновые кислоты-это очень длинные полимерные цепочки, состоящие из мононуклеотидов, соединенных 5'-3'-фосфодиэфирными связями. Интактная молекула РНК содержит от 100 до 100000 и более нуклеотидов. Интактная молекула ДНК содержит в зависимости от вида организмов от нескольких тысяч до многих миллионов нуклеотидов. В те времена, когда Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти ставили свои эксперименты на ДНК пневмококков, считалось, что структура молекул ДНК относительно проста и представляет собой определенную тетрануклеотидную последовательность, например рАрСрGрТ_ОН, многократно повторенную, так что она образует полимер вида (рАрСрGрТ)_n. Таким образом, казалось, что ДНК не обладает сложностью, необходимой для того, чтобы служить веществом наследственности.

Последующие химические исследования Эдвина Чаргаффа по составу ДНК многих различных организмов убедили научную общественность в том, что ДНК в действительности обладает сложностью, необходимой для передачи наследственной информации. Исследования Чаргаффа показали, что состав оснований в ДНК различен у различных видов организмов. Это наблюдение исключило возможность того, что все молекулы ДНК состоят из одинаковых тетрануклеотидов. Исследования Чаргаффа выявили также одну замечательную особенность, присущую всем молекулам ДНК: молярное содержание аденина равно содержанию тимина, а молярное содержание гуанина-содержанию цитозина. Эти равенства называются правилами Чаргаффа: [А] = [Т], [G] = [С] ; количество пуринов равно количеству пиримидинов. В зависимости от видовой принадлежности меняется лишь отношение ([А] + [T])/([G] + [С]) (табл. 4.1).

Наблюдения Чаргаффа показали, что молекула ДНК может быть устроена много сложнее, чем предполагали до того, поскольку в соответствии с полученными им данными молекулы ДНК могли представлять собой самые различные последовательности оснований. Вскоре после работ Чаргаффа Уотсон и Крик фактически показали, что правила Чаргаффа не накладывают никаких ограничений на возможное число различных последовательностей оснований, которые могут образовывать молекулы ДНК.

Рис. 4.8. А. Нуклеотиды - это единицы, из которых построены нуклеиновые кислоты. Обратите внимание на нумерацию атомов углерода и азота в пуриновом и пиримидиновом кольцах. Атомы углерода сахара нумеруются отдельно с использованием штрихованных цифр. Б и В. Обратите внимание на сходство и различие полимеров ДНК и РНК.

Таблица 4.1. Состав оснований ДНК различных организмов
Организмы —	Состав оснований (моль %)				Отношение оснований			Асимметрия
	A	G	С	Т	А/Т	G/C	Ри/Ру
Животные
Человек	30,9	19,9	19,8	29,4	1,05	1,00	1,04	1,52
Овца	29,3	21,4	21,0	28,3	1,03	1,02	1,03	1,36
Курица	28,8	20,5	21,5	29,2	1,02	0,95	0,97	1,38
Черепаха	29,7	22,0	21,3	27,9	1,05	1,03	1,00	1,31
Лосось	29,7	20,8	20,4	29,1	1,02	1,02	1,02	1,43
Морской краб	47,3	2,7	2,7	47,3	1,00	1,00	1,00	17,50
Морской еж	32,8	17,7	17,3	32,1	1,02	1,02	1,02	1,58
Саранча	29,3	20,5	20,7	29,3	1,00	1,00	1,00	1,41
Растения
Зародыш пшеницы	27,3	22,7	22,8	27,1	1,01	1,00	1,00	1,19
Дрожжи	31,3	18,7	17,1	32,9	0,95	1,09	1,00	1,79
Гриб Aspergillus niger	25,0	25,1	25,0	24,9	1,00	1,00	1,00	1,00
Бактерии
Escherichia coli	24,7	26,0	25,7	23,6	1,04	1,01	1,03	0,93
Staphylococcus aureus	30,8	21,0	19,0	29,2	1,05	1,11	1,07	1,50
Clostridium perfringens	36,9	14,0	12,8	36,3	1,01	1,09	1,04	2,70
Brucella abortus	21,0	29,0	28,9	21,1	1,00	1,00	1,00	0,72
Sarcina lutea	13,4	37,1	37,1	12,4	1,08	1,00	1,04	0,35
Бактериофаги
T7	26,0	24,0	24,0	26,0	1,00	1,00	1,00	1,08
λ	21,3	28,6	27,2	22,9	0,92	1,05	1,00	0,79
фХ174 (вирусная форма)	24,6	24,1	18,5	32,7	0,75	1,30	0.95	1,34
фХ174 (репликативная форма)	26,3	22,3	22,3	26,4	1,00	1,00	1,00	1,18
По Lehninger A. L. (1975). Biochemistry, 2nd ed., Worth Publishers, New York.

Модель структуры ДНК Уотсона-Крика

В 1953 году Джеймс Уотсон и Френсис Крик предложили модель структуры ДНК, которая с тех пор многократно проверялась и признана правильной в целом и во многих деталях. Их модель основывалась на четырех группах данных (рис. 4.9):

1. ДНК представляет собой полимер, состоящий из нуклеотидов, соединенных 3'-5'-фосфодиэфирными связями.

2. Состав нуклеотидов в ДНК подчиняется правилам Чаргаффа.

3. Рентгенограммы волокон ДНК, впервые полученные Морисом Уилкинсом и Розалиндой Франклин, указывают на то, что молекулы обладают спиральной структурой и содержат более одной полинуклеотидной цепи.

4. Кислотно-щелочное титрование нативной ДНК показывает, что ее структура стабилизируется водородными связями. Титрование и нагревание нативной ДНК вызывают заметные изменения ее физических свойств, в частности вязкости, переводя ее в «денатурированную» форму, причем ковалентные связи не разрушаются.

Рис. 4.9. Наблюдения, использованные Уотсоном и Криком при построении модели структуры ДНК. А. Нуклеотиды связаны 3'-5'-фосфодиэфирными связями. Б. Правила Чаргаффа. В. Нагревание приводит к изменению физических свойств нативной ДНК, но не разрывает ковалентные связи (Prof. Maurice H. F. Wïlkins, Kings College, London).

Рис. 4.10. Пара оснований, связанных в ДНК водородной связью. Аденин образует пару с тимином посредством двух водородных связей, а гуанин связан с цитозином тремя водородными связями. Обратите внимание на то, что водородными связями соединяются пурины (аденин и гуанин) с пиримидинами (тимином и цитозином). Водородные связи много слабее ковалентных, соединяющих отдельные атомы каждого нуклеотида, но достаточно сильны для того, чтобы обеспечить специфичность образования пар А — Т и G — С.

Чтобы объяснить эти наблюдения, Уотсон и Крик предположили, что природная (нативная) молекула ДНК представляет собой две полимерные цепи попарно соединенных нуклеотидов, закрученные в форме двойной спирали. Сцепление между цепями обеспечивается особыми водородными связями между аденином и тимином и между гуанином и цитозином (рис. 4.10). Такое попарное сопоставление нуклеотидоз, при котором А комплементарен Т, a G комплементарен С, было выведено с помощью построения молекулярных моделей, на которых точно выдерживались все межатомные расстояния. Построение молекулярной модели гипотетической двойной спирали также потребовало антипараллельности нуклеотидных цепочек, как это изображено на рис. 4.11.

Предположенная специфичность водородных связей между аденином и тимином и между гуанином и цитозином объясняет наблюдавшееся Чаргаффом постоянство отношений А/Т и G/C и отражает комплементарность цепей двойной спирали. Более того, для любой последовательности оснований возможна равная ей по длине комплементарная последовательность, составляющая вторую цепь двойной спирали. Конкретная последовательность пар А — Т и G — С может быть видоспецифична и не влияет на структуру молекулы ДНК, образующую двойную спираль. Возможное число различных последовательностей пар оснований в молекуле ДНК практически бесконечно и способно кодировать колоссальное количество информации. Этот факт делает очень привлекательной гипотезу о том, что ДНК может служить веществом наследственности для всех организмов. Из модели также следует, что физическая структура нативной ДНК может сильно изменяться при нагревании или титровании, не нарушающих ковалентных связей, но разрывающих водородные связи, так что две цепи отделяются друг от друга. Пространственная и молекулярная модель предложенной Уотсоном и Криком двойной спирали ДНК изображена на рис. 4.12. Обратите внимание на то, что для разделения двух цепей им необходимо расплестись друг относительно друга.

Рис. 4.11. Две цепи молекулы ДНК расположены «антипараллельно», так что 5'-конец одной цепи соединен с З'-концомдругой.

Модель Уотсона - Крика позволяет представить себе, как может удваиваться нативная молекула ДНК, образуя две одинаковые дочерние молекулы. Поскольку две цепи ДНК комплементарны, каждая из них при расплетании двойной спирали может служить матрицей для синтеза новой комплементарной цепи. Последовательность оснований во вновь синтезируемой цепи будет определяться спецификой водородных связей между основаниями цепи-шаблона и вновь образуемой цепи (рис. 4.13). Таким образом, генетическая информация, содержавшаяся в последовательности пар оснований родительской молекулы, будет полностью воспроизведена в двух дочерних молекулах. Более того, если в процессе удвоения ДНК произошла ошибка и какой-то нуклеотид во вновь образуемой цепи выпал или оказался некомплементарным исходному, то это может изменить информационное содержание молекулы, причем можно ожидать, что эта ошибка будет передана дочерним молекулам ДНК в следующих поколениях. Такая замена пары нуклеотидов может обладать свойствами генетических мутаций. Таким образом, модель структуры ДНК Уотсона и Крика объясняет как способность генов к самоудвоению (репликации), так и их информационные свойства.

Рис. 4.12. Пространственная модель молекулы ДНК; видна закрученность цепей друг относительно друга. Обратите внимание на плотную упаковку пар оснований в двойной спирали.

Проверка модели Уотсона-Крика

Модель двойной спирали ДНК была предложена в 1953 г. и знаменовала рождение новой науки-молекулярной биологии. Однако прошло пять лет, прежде чем были получены первые убедительные экспериментальные подтверждения модели Уотсона-Крика в работах Мэтью Мезелсона и Франклина Сталя. В этих экспериментах было показано, что в точном соответствии с предсказаниями модели репликация ДНК происходит полу консервативно: каждая дочерняя молекула ДНК состоит из одной интактной (консервативной) цепи, полученной от родительской двойной спирали, и одной вновь синтезированной цепи. С другой стороны, можно представить себе гипотетические механизмы репликации ДНК, которые не предсказываются моделью двойной спирали, а именно: 1) консервативный способ репликации, при котором родительская ДНК полностью сохраняется, а дочерние молекулы ДНК полностью синтезируются заново, и 2) дисперсный способ, при котором обе дочерние молекулы ДНК синтезируются заново, а родительская молекула распадается на нуклеотиды, которые могут входить или не входить в состав дочерних молекул.

Рис. 4.13. Предложенная Уотсоном и Криком модель репликациидвойной спирали ДНК.

Рис. 4.14. Разделение молекул ДНК с различной плотностью посредством центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Схематически изображены последовательные этапы эксперимента Мезелсона и Сталя, показавшего полуконсервативный механизм репликации ДНК Е. coli.

Чтобы определить, каким из этих способов реплицируется ДНК. надо уметь отличать дочерние молекулы от родительских. Мезелсон и Сталь выращивали Е. coli на среде, содержащей в качестве источника азота ¹⁵N. Тяжелый изотоп азота ¹⁵N включался в состав ДНК и служил меткой. Для того чтобы пометить изотопом ¹⁵N практически всю бактериальную ДНК, достаточно вести культивирование на такой среде в течение двенадцати поколений. Молекулы, содержащие ¹⁵N, можно отличить от молекул, содержащих более легкий, обычный изотоп, по плотности, так как у ДНК с ¹⁵N масса одного нуклеотида больше, чем у обычной ДНК. Молекулы ДНК с различной плотностью могут быть разделены центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия (рис. 4.14). В процессе центрифугирования молекулы ДНК собираются в том слое, в котором плотность раствора равна их собственной плотности. ДНК клеток Е. coli, выращенных на среде, содержащей ¹⁵N, имеет плотность 1,724 г/см³, тогда как ДНК клеток, выращенных на обычной среде с изотопом ¹⁴N, имеет плотность 1,710 г/см³. Смесь этих двух типов ДНК легко разделяется при центрифугировании по плотности (рис. 4.14).

Аналогией, иллюстрирующей принцип центрифугирования в градиенте плотности, может служить погружение подводной лодки. Регулируя количество воды в балластных танках (баках), подводная лодка может зависать на желаемой глубине, плотность воды на которой равна средней плотности подводной лодки. Если набрать в танки больше воды, вытеснив соответствующее количество воздуха, то плотность подводной лодки увеличивается, и она погружается, попадая в слои более холодной воды с большей плотностью. Когда плотность воды оказывается равной плотности подводной лодки, лодка снова зависает на новой глубине.

В эксперименте Мезелсона и Сталя клетки, в течение многих поколений культивируемые на среде с ¹⁵N, быстро переносили в среду, содержавшую ¹⁴N. Через определенные промежутки времени отбирали пробы растущей культуры и в каждой из них определяли плотность ДНК. Результаты представлены на рис. 4.15. После первого деления на среде с ¹⁴N плотность ДНК культуры была промежуточной между [¹⁵N] ДНК и [¹⁴N] ДНК. После второго деления на среде с ¹⁴N половина клеток имела легкую ДНК, а вторая половина - ту же, что и в предыдущем поколении (промежуточную). После третьего деления на среде с ¹⁴N 3/4 ДНК имело плотность, равную плотности [¹⁴N] ДНК и 1/4 сохраняла промежуточную плотность. Соотношение между числом генераций и распределением плотности ДНК в точности соответствовало полуконсервативному типу репликации, предсказываемому моделью Уотсона-Крика (рис. 4.15).

Кроме того, модель предсказывала, что ДНК с промежуточной плотностью должна представлять собой гибридную двойную спираль, одна из цепей которой содержит только тяжелый изотоп азота (N¹⁵), а другая-только легкий. Мезелсон и Сталь нагревали ДНК промежуточной плотности в течение 30 мин при температуре 100°С, что, как уже было известно, изменяет физические свойства молекулы, не разрывая ковалентных связей, и обнаружили, что она превращается в две равные по объему фракции ДНК с разными плотностями. Плотность одной из фракций, образовавшихся в результате нагревания, совпадала с плотностью тяжелой ДНК, а другой-с плотностью легкой ДНК (рис. 4.15).

Рис. 4.15. А. Распределение плотности молекул ДНК, наблюдавшееся Мезелсоном и Сталем после перенесения растущих клеток Е. coli из тяжелой среды в легкую. Б. Схематическая интерпретация результатов, представленных на А. ДНК, меченная ¹⁵N, и вновь синтезируемая ДНК, имеющая ¹⁴N, изображены разным цветом. В. Нагревание ДНК промежуточной плотности превращает ее в одноцепочечную ДНК, содержащую две фракции, плотность одной из которых совпадает с плотностью нагретой ДНК, меченной ¹⁵N, а другой -меченной ¹⁴N.

Из этого было сделано заключение, что ДНК промежуточной плотности, образующаяся после первого деления в легкой среде, представляет собой гибридную молекулу, состоящую из одной родительской цепи, содержащей только тяжелый изотоп азота, и другой, вновь синтезированной дочерней цепи, как это предсказывает модель Уотсона-Крика. Аналогичные эксперименты проделывали с реплицирующейся ДНК множества различных прокариотических и эукариотических организмов, и каждый раз оказывалось, что ДНК реплицируется полуконсервативно. Эксперименты Мезелсона-Сталя были первым доказательством справедливости модели Уотсона - Крика. В настоящее время можно с уверенностью сказать, что основные положения этой модели убедительно подтверждены и структура двойной спирали легла в основу современной генетики.

Различные формы организации двухцепочечной ДНК

Пионерская работа Уилкинса и Франклин показала, что молекулы ДНК могут давать различную дифракционную картину в рентгеновских лучах в зависимости от содержания воды и солей. Модель, предложенная Уотсоном и Криком, соответствовала значениям параметров структуры, полученным на основе рентгенограммы так называемой В-формы ДНК, изображенной на рис. 4.9. Модель В-формы ДНК, представленная на рис. 4.12, характеризуется плоскопараллельным расположением пар нуклеотидных оснований внутри двойной спирали. Плоскости оснований почти перпендикулярны оси спирали и отстоят друг от друга на 3,4 А. Этой повторяющейся единице соответствуют яркие меридиональные дуги в верхней и нижней частях рентгенограммы, изображенной на рис. 4.9. Диаметр спирали почти в точности равен 20 А, а соседние пары нуклеотидных оснований повернуты друг относительно друга на 36°. В результате на один виток спирали приходится десять пар оснований. На рисунке изображена спираль с правым направлением вращения. Рентгенограмма ДНК, однако, не дает информации, достаточной для того, чтобы судить, является спираль правой или левой. При построении своей модели Уотсон и Крик выбрали направление вращения произвольно.

Все возможное разнообразие структур двухцепочечных молекул ДНК стало ясным относительно недавно в результате экспериментов по кристаллизации гомогенных двухцепочечных олигомеров ДНК, получаемых посредством химического синтеза. Дифракционные рентгеновские картины, полученные на таких кристаллах ДНК, более четки, чем получаемые на природной ДНК, и позволяют определить с большой точностью положения отдельных атомов. Эти исследования обнаружили, что как право-, так и левозакрученная двухцепочечная спираль ДНК может существовать в нескольких модификациях, характеризуемых различными значениями параметров (табл. 4.2). Тип спирали определяется свойствами растворителя и последовательностью нуклеотидов.

Самокомплементарный тетрамер ДНК типа CGCG (5'-конец всегда пишется слева) образует при кристаллизации левозакрученную двухцепочечную структуру, получившую название Z-ДНК из-за зигзагообразного характера фосфодиэфирного каркаса. Напротив, самокомплементарный додекамер CGCGAATTCGCG кристаллизуется в форме правозакрученной двухцепочечной спирали В-формы, хотя этот додекамер содержит на обоих своих концах последовательность CGCG, которая сама по себе кристаллизуется в Z-форме. Эти две формы ДНК изображены для сравнения рядом на рис. 4.16.

	Форма
	А	В	С	Z
Спираль	Правая	Правая	Правая	Левая
Число пар оснований в одном витке спирали
Число пар оснований в одном витке спирали
Угол между соседними парами оснований
Угол между соседними парами оснований
Расстояние между соседними парами оснований
Расстояние между соседними парами оснований
Угол наклона оснований к оси спирали
Угол наклона оснований к оси спирали
Диаметр спирали (приблизительно)

Рис. 4.16. Пространственные модели левозакрученной Z-формы ДНК и правозакрученной B-формы. (Prof. Alexander Rich, Massachusetts Institute of Technology.)

Рис. 4.17. Политенные хромосомы дрозофилы, обработанные флуоресцентными антителами, связывающимися с Z-ДНК. А. Поперечная исчерченность политенных хромосом на фотографии, сделанной в фазово-контрастном микроскопе. Б. Флуоресцентная микрофотография того же препарата, на которой светлые полосы указывают локализацию Z-ДНК. (Prof. Alexander Rich, Massachusetts Institute of Technology.)

Исследования структуры полимера (CG)_n в растворе показали, что эта молекула может существовать в одной из двух альтернативных форм, а именно в правой В-форме или левой Z-форме. Эти две формы переходят друг в друга при изменении ионной силы раствора или катионов, нейтрализующих отрицательный заряд на фосфодиэфирном каркасе. Природные молекулы ДНК в основном существуют в правой В-форме, если они не содержат последовательностей типа (GC)_n. Однако если такие последовательности входят в состав ДНК, то эти участки при соответствующих условиях могут переходить в Z-форму. Возможность такого перехода указывает на то, что две цепи в двойной спирали ДНК находятся в динамическом состоянии и могут раскручиваться друг относительно друга, переходя из правой формы в левую и наоборот. Ясно, что молекулы ДНК для этого должны быть довольно лабильны и допускать конформационные превращения. Биологические следствия такой лабильности структуры ДНК пока не вполне понятны. Специфичные к Z-ДНК антитела реагируют с определенными участками гигантских хромосом клеток слюнных желез дрозофилы, что свидетельствует о том, что ДНК в хромосомах существует в обеих формах (рис. 4.17).

Организация ДНК в хромосомах

Молекулы ДНК в эукариотических хромосомах очень велики. Длина молекул ДНК, выделенных из клеток дрозофилы, достигает 1,2 см, и принято считать, что каждая эукариотическая хромосома содержит одну-единственную непрерывную молекулу ДНК. Упаковка таких огромных молекул в ядрах клеток является основной функцией гистонов, белков, характерных именно для эукариотических клеток.

Основная структурная единица эукариотической клетки - это нуклеосома (рис. 4.18). Нуклеосома содержит по две молекулы каждого из четырех гистонов, Н2А, Н2В, НЗ и Н4, соединенных в форме октамера. Каждый октамер связан с последовательностью из примерно 200 нуклеотидных пар длиной около 700 А. Точное взаимное расположение гистона и ДНК в нуклеосоме неизвестно, но считается, что ДНК каким-то образом наматывается на октамеры гистона. Нуклеосома имеет диаметр около 100 Å, и таким образом ДНК в нуклеосоме должна быть сложена примерно всемеро. Другой гистон, HI, обеспечивает связь между нуклеосомами, последовательность которых образует подобие винта (рис. 4.19). Диаметр этого винта (называемого соленоидом) составляет по одним оценкам около 300 Å, по другим -около 500 Å. Это различие, вероятно, обусловлено тем, что для приготовления электронно-микроскопических препаратов использовали разные методы. Если принять диаметр соленоида равным 300 Å, то упаковка последовательности нуклеосом в форме соленоида дает дополнительное уменьшение линейных размеров структуры в целом еще в 6 раз. В интерфазных хромосомах сам соленоид закручен винтом, образуя при этом полую трубку диаметром около 2000 Å, что дает очередное сокращение линейных размеров содержащей ДНК структуры еще примерно в 18 раз (рис. 4.20).

Рис. 4.18. Электронная микрофотография эукариотического хроматина, на которой видны нуклеосомы, соединенные тяжами со свободной ДНК. (Dr. Jack D. Griffith, University of North Carolina at Chapel Hill.)

Рис. 4.19. Схематическое изображение участка соленоида; цепочка нуклеосом (сферы), каждая из которой обмотана ДНК, образует винтовую линию.

Переход от интерфазной хромосомы к метафазной хроматиде, вероятно, связан с еще одним аналогичным закручиванием теперь уже трубки диаметром в 2000 Å в винтовую структуру диаметром около 6000 Å (рис. 4.20). Эта общая схема организации ДНК в ядрах клеток игнорирует различия в степени спирализации, которые почти наверняка существуют между теми участками хромосом, которые участвуют в синтезе РНК и репликации ДНК, и теми, которые в этих процессах не участвуют. Кроме того, гетерохроматиновые участки хромосом более компактны, чем эухроматиновые. В любом случае ДНК в ядрах эукариотических клеток образует иерархическую систему спиралей, основной единицей которой является нуклеосома.

Хромосомы прокариотических клеток представляют собой кольцевые молекулы ДНК; у Е. coli длина кольца составляет 10⁷ Å, т.е. около 1 мм. Эта огромной длины кольцевая нить помещается в клетке длиной лишь 2·10⁴ Å при диаметре около 8·10³ Å. Следовательно, ДНК может существовать в клетке лишь в высокоупорядоченном (конденсированном) состоянии. Хотя в прокариотических клетках нет белков гистонов, в них тем не менее содержатся некоторые белки, образующие комплексы с ДНК. При электронной микроскопии разрушенных определенным образом клеток Е. coli можно видеть, что ДНК собрана в «бусины», по величине очень близкие нуклеосомам эукариот (рис. 4.21). Эти бусины очень лабильны, что указывает на то, что взаимодействие между ДНК и белками в клетках Е. coli много слабее, чем между ДНК и гистонами эукариот. Характер иерархической конденсации хромосомы Е. coli не вполне понятен, но хромосома в целом может быть выделена в виде компактной структуры, называемой нуклеоидом.

Рис. 4.20. Пространственные модели интерфазной и метафазной эукариотической хромосомы. А. Схематическое изображение винтовых структур, начиная от двойной спирали Уотсона - Крика диаметром 20 Å ; далее нуклеосома — 100 Å, соленоид — 300 Å, трубка— 2000 Å и, наконец, метафазная хроматида - 6000 Å. Б. Пространственная модель двух последних уровней организации метафазной хроматиды, сделанная из проволоки. Тончайшие белые поперечные линии на проволоке (указаны белой стрелкой) представляют двойную спираль Уотсона -Крика диаметром 20 Å, белая черта указывает диаметр соленоида (300 Å), черная –диаметр трубки (2000 Å). В. Модель метафазной хромосомы в меньшем масштабе, чем на Б (черная черта по-прежнему обозначает 2000 Å). Тончайшие белые линии (слева) означают последовательность нуклеосом диаметром 100 Å, закрученную в соленоид диаметром 300 Å; последние уровни иерархии — трубка диаметром 2000 Å и хроматида — 6000 А. Участок трубки диаметром 2000 А в середине рисунка — это центромера, соединяющая два плеча метацентрической хромосомы. [Sedat J., Manuelidis L. (1979). Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 42, 346.]

Рис. 4.21. Электронная микрофотография разрушенной клетки. Препарат приготовлен таким образом, что видны «бусы», образуемые соединением ДНК с белком. [Griffith J.D. (1976). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 563.]

Не вся ДНК эукариотических клеток находится в ядрах клеток. Митохондрии и недифференцированные хлоропласты растений, так называемые пластиды, представляют собой самореплицирующиеся органеллы и содержат собственные кольцевые молекулы ДНК. Эти молекулы очень невелики и кодируют ограниченное количество информации, необходимой для осуществления органеллами их функций. Так же как и хромосомы прокариот, они не связаны с гистонами и образуют внутри органелл нуклеоиды.

Общие особенности репликации ДНК

Нативные молекулы ДНК очень велики и при экстракции из клеток обычно разрываются в результате физических или ферментативных воздействий. Мезелсон и Сталь в своих экспериментах по репликации ДНК Е. coli имели дело со сравнительно небольшими фрагментами ДНК, и полученные ими результаты относятся только к состоянию ДНК, предшествовавшему репликации и после нее. Полная репликация хромосомы Е. coli впервые наблюдалась Джоном Кейрнсом. Он разработал метод очень мягкого разрушения клеток Е. coli. В результате Кейрнсу удалось выделить интактные хромосомы Е. coli и пометить их радиоактивным ³Н-тимидином. Меченые хромосомы аккуратно переносили из раствора на твердую поверхность, которая затем покрывалась в темноте фотографической эмульсией и в течение нескольких недель экспонировалась. В это время электроны, испускаемые радиоактивной ДНК, вызывали образование зерен серебра в фотоэмульсии вдоль молекул ДНК. Последующая обработка эмульсии дает радиоавтограф хромосомы, на котором цепочка зерен серебра отслеживает конформацию молекулы ДНК. Применение метода радиоавтографии привело прежде всего к установлению того факта, что ДНК Е. coli имеет кольцевую форму (рис. 4.22). Впоследствии было показано, что такую же форму имеет ДНК всех прокариотических организмов, а также вирусов и органелл эукариотических организмов.

В настоящее время для молекул ДНК известны три основные конформации и соответственно три основных способа репликации. Кольцевые молекулы ДНК, например реплицирующаяся форма ДНК фага лямбда, могут реплицироваться способом, обнаруженным на радиоавтографах хромосом Е. coli. Репликация кольцевой молекулы ДНК начинается в определенной точке кольца и приводит к образованию «вздутия», расширяющегося в двух направлениях вдоль хромосомы по мере репликации (рис. 4.22). Этот способ репликации ДНК ведет к образованию промежуточной структуры, напоминающей греческую букву Θ. Тета-тип репликации превращает родительскую кольцевую хромосому в две дочерние кольцевые хромосомы, в каждой из которых сохраняется одна из цепей родительской молекулы ДНК, а вторая цепь заново синтезируется.

Рис. 4.22. А. Радиоавтограф целой хромосомы Е. coli, меченной Н³-тимидином. В большую часть кольцевой хромосомы специфическая импульсная метка включается слабо. Участки с высокой специфической активностью указаны стрелками. Они соответствуют месту окончания репликации молекулы ДНК (слева внизу) и началу нового цикла репликации (сверху справа). [Rodriguez R.L., Dalbey M.S., Davern C.I. (1973). J. Mol. Biol., 74, 599.] Б. Начало синтеза родительской ДНК при репликации бактериофага лямбда по тета-типу. (Dr. David Dressier and Dr. John Wolsfson, Harvard University.) B. Схема двунаправленной репликации кольцевой молекулы ДНК.

Рис. 4.23. А. Электронная микрофотография ДНК бактериофага лямбда в период синтеза линейной дочерней молекулы при репликации по сигма-типу. [Kiger J. Α., Jr., Sinsheimer R.L. (1971). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 112.]

Б. Схема репликации ДНК сигма-типа.

Рис. 4.24. А. Реплицирующаяся ДНК Drosophila melanogaster. Обратите внимание на множество «вздутий», соответствующих участкам репликации ДНК. Изображен фрагмент ДНК, состоящий из 119000 пар нуклеотидов и включающий 23 вздутия (раздвоения). Масштабная черточка соответствует длине последовательности 5000 пар нуклеотидов. [Kriegstein H.J., Hogness O.S. (1974). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 135.]

Б. Схема двунаправленной репликации линейной молекулы ДНК.

Как мы увидим в дальнейшем, жизненный цикл некоторых организмов требует превращения кольцевой хромосомы в линейную. Такое превращение происходит при другом типе репликации ДНК, известном под названием сигма-типа (от греческой буквы σ) или «катящегося кольца». Сигма-репликация начинается с разрыва фосфодиэфирной связи в одной из цепей родительской кольцевой молекулы, в результате чего по обе стороны разрыва образуются «голые» 3'-ОН- и 5'-РО₄-концы. Затем комплементарная кольцевая цепь служит матрицей для синтеза новой цепи, ковалентно прикрепленной к 3'-ОН-концу разорванной родительской цепи. По мере того как новая цепь наращивается на 3'-ОНконце, 5'-РО₄-конец той же цепи смещается, образуя «хвост» кольца. Затем начинается синтез цепи, комплементарной этому хвосту (рис. 4.23). При таком способе репликации промежуточная структура имеет форму буквы «сигма». По мере продолжения репликации кольцевая родительская молекула превращается в две дочерние молекулы, одна из которых кольцевая, а другая -линейная. Сигма-репликация является необходимым этапом жизненного цикла некоторых бактериофагов, в частности лямбда и фХ174. Этот тип репликации имеет место при половой конъюгации бактерий и встречается в оогенезе некоторых эукариотических организмов.

Хромосомы некоторых вирусов и всех эукариотических организмов содержат линейные молекулы ДНК. Репликация линейных молекул начинается в определенных точках с образования репликационных вздутий. В небольших молекулах ДНК вирусов репликация может начинаться с одной точки. В больших молекулах ДНК, образующих хромосомы эукариот, иногда насчитываются сотни точек инициации репликации (рис. 4.24). После образования вздутия оно начинает увеличиваться по мере распространения процесса репликации ДНК в обоих направлениях от точки инициации. По ходу процесса соседние вздутия могут сливаться, а когда вздутие достигает конца молекулы, образуется характерная промежуточная Y-образная конфигурация. Когда репликация заканчивается, из одной линейной родительской молекулы образуются две линейные дочерние, каждая из которых, так же как и родительская, представляет собой двойную спираль.

Процесс репликации ДНК играет ключевую роль в передаче наследственной информации, записанной в последовательности пар оснований от родительской молекулы ДНК дочерним молекулам ДНК, от родительских соматических клеток - дочерним соматическим клеткам и, наконец, от родительского организма - потомкам.

Литература

Avery О. Т., MacLeod С. M., McCarty M. (1944). Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of Pneumococcal types, J. Exp. Med., 79, 137-158.

Cairns J. (1963). The bacterial chromosome and its manner of replication as seen by autoradiography, J. Mol. Biol., 6, 208-213.

Dickerson R. E., Drew H. R., Conner B. N.. Wing R.M., Fratini A.V., Kopka M.L. (1982). The anatomy of A-, B-, and Z-DNA, Science, 216, 475-485.

Hershey A.D., Chase M . (1952). Independent functions of viral protein and nucleic acidin growth of bacteriophage, J. Gen. Physiol., 36, 39-56.

Kavenoff R., Zimm B. (1973). Chromosome-sized DNA molecules from Drosophila, Chromosoma, 41, 1-27.

Meselson M., Stahl F. (1958). The replication of DNA in Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 44, 671-682.

Nordheim A., Pardue M. L., Lafer E. M., Mutter A., StollarB.D., Rich A. (1981). Antibodies to left-handed Z-DNA bind to

interband regions of Drosophila polytene chromosomes, Nature, 294, 417-422.

Wang A.H.-J., Quigley G.J., Kolpak F.J., Crawford J. L., van Boom J. H., van der Marel G., Rich A. (1979). Molecular structure of a left-handed double helical DNA fragment at atomic resolution, Nature, 282, 680-686.

Watson J. D., Crick F.H.C. (1953). Molecular structure of nucleic acids. A structure for deoxyribose nucleic acid, Nature, 171, 737-738.

Watson J.D., Crick F.H.C. (1953). Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid, Nature, 171, 964-967.

Wilkins M.H.F. et al. (1953). Molecular structure of deoxypentose nucleic acids, Nature, 171, 738-740.

Chromatin, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology XLII, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1978.

Chromosome Structure and Function, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology XXXVIII, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1973.

Ключевые слова и понятия

Ауксотроф

Водородная связь

Гистон

Двойная спираль

ДНК

Колония

Негативная колония (бляшка)

Нуклеозид

Нуклеоид

Нуклеосома

Нуклеотид

Основание

Полуконсервативная репликация

Правило Чаргаффа

Прототроф

Радиоавтография

Репликация сигма-типа

Репликация тета-типа

РНК

Трансформация

Фосфодиэфирная связь

Эксперимент Мезельсона -Сталя

Эксперимент Херши - Чейза

В-форма ДНК

Z-форма ДНК

Задачи

4.1. Суспензию бактерий последовательно разводят 1/100, 1/100 и 1/50, по 0,2 мл суспензии из последнего разведения высевают на поверхность трех чашек Петри с агаризованной средой. После инкубации на этих чашках появилось 105, 84 и 98 бактериальных колоний. Какова была примерная концентрация бактерий в исходной культуре? Ту же исходную культуру, разведенную последовательно 1/100, 1/100, 1/10, наносят по 0,2 мл на поверхность трех чашек Петри, засеянных фагом Т2. На чашках выросло 40, 25 и 30 колоний. Какова частота возникновения устойчивых к фагу Т2 бактерий в исходной культуре?

4.2. Каковы были бы результаты экспериментов Мезельсона и Сталя, если бы ДНК реплицировалась консервативно? А если дисперсно?

4.3. Некоторые ДНК-фаги, например фХ174, содержат одну кольцевую молекулу ДНК. Каков, по вашему мнению, механизм репликации их генома? Выделенная из фага ДНК способна заражать сферопласты Е. coli; однако разрыв даже одной фосфодиэфирной связи в ДНК де-

зоксирибонуклеазой (фермент, расщепляющий такие связи) лишает молекулу ДНК инфекционности. Молекулы ДНК того же фага, выделенные из инфицированных клеток, намного устойчивее к дезоксирибонуклеазе. Почему?

4.4. Синтетический полимер dA/dT (d обозначает дезоксирибозу) - это двухцепочечная молекула, у которой одна цепь-poly-dA, а вторая - poly-dT; он характеризуется определенной температурой плавления (Т_т). Это температура, при которой половина нуклеотидов существует в двухцепочечной форме, а половина -в одноцепочечной. Температура плавления poly-dA/dT ниже, чем polydG/dC. Как вы думаете, почему? Воспользовавшись данными, приведенными в табл. 4.1, оцените относительные значения Т_т для ДНК человека, Е. coli и Sarcina lutea.

4.5. В районе исследовательской станции Южного полюса упал метеорит типа угольного хондрита. С его поверхности выделены вирус, названный Z1, и его хозяин. Продумайте постановку эксперимента, позволяющего определить, что является наследственным веществом Z1,

белок или ДНК. Продумайте возможные результаты эксперимента в обоих случаях.

4.6. Установлено, что наследственным веществом вируса Z1 и его хозяина является ДНК. Для определения

способа репликации ДНК клеток хозяина был поставлен эксперимент типа Мезелсона - Сталя. Результаты эксперимента представлены на рис. 4.25. Каков способ репликации?

5. Геном эукариот

Ген - это функциональная единица, часть молекулы ДНК. Полное описание структуры и организации генов какого-либо организма подразумевает описание последовательности нуклеотидов в ДНК этого организма. Однако описание полной последовательности нуклеотидов в молекулах ДНК даже мельчайших вирусов составляет колоссальную проблему, практически неразрешимую для молекул ДНК высших организмов. Действительно, существующее у всех видов организмов генетическое разнообразие свидетельствует о том, что ни одна последовательность нуклеотидов в геноме не является уникальной и инвариантной для всех особей вида. Геном Е. coli состоит примерно из 3,2·10⁶ нуклеотидных пар (н.п.). .Ясно, что даже для такого небольшого генома, как Е. coli, возможно огромное количество различных нуклеотидных последовательностей. Для каждой нуклеотидной пары существуют четыре возможности (AT, TA, GC, CG), и, следовательно, число возможных нуклеотидных последовательностей в генотипе Е. coli составляет= =. Число возможных последовательностей в молекуле ДНК человека, очевидно, много больше этого огромного числа. Содержание ДНК в гаплоидном геноме некоторых эукариотических организмов представлено на рис. 5.1. Числа на шкале показывают, во сколько раз количество ДНК превышает количество ДНК в геноме Е. coli.

Из сказанного выше становится ясно, почему большая часть современных знаний о генетической организации ДНК основана на генетическом анализе, а не на химическом анализе последовательностей нуклеотидов в ДНК. Генетический анализ позволяет составлять подробные модели (карты) генетической организации хромосом. Для многих организмов оказалось возможным очень точное сопоставление таких генетических карт с физической организацией ДНК в соответствующих хромосомах. Основы такого генетического анализа были заложены Менделем (гл. 2). Наблюдавшееся Менделем независимое распределение аллелей отвечает расположению соответствующих генов в разных хромосомах и, следовательно, в разных молекулах ДНК. В этой главе описывается применение генетического анализа к изучению генетической организации ДНК отдельных хромосом.

Рис. 5.1. Относительное количество ДНК в гаплоидном наборе клеток различных организмов. За единицу принято содержание ДНК в геноме Е. coli (3,2·10⁶ нуклеотидных пар). (J.D. Watson, Molecular Biology of the Gene, 3rd ed., W. A. Benjamin, Menlo Park, Calif., 1976.)

Методы генетического анализа развивались применительно к генетике диплоидных эукариотических организмов. Поскольку эти методы разработаны исходно для организмов, жизненный цикл которых включает мейоз, то именно для таких организмов они и излагаются в этой главе. В последующих главах мы увидим, как методология анализа используется при изучении генетической организации бактерий и вирусов, у которых мейоза нет.

Для того чтобы достичь максимального понимания генетической организации, генетики сосредоточили свое внимание на изучении сравнительно небольшого числа организмов, наиболее удобных для генетического анализа. Из эукариотических организмов в качестве объекта была выбрана плодовая мушка Drosophila melanogaster. Среди бактерий таким организмом послужила Е. coli, а среди вирусов - бактериофаги Т2, Т4, лямбда и фХ174. Изучение этих геномов послужило парадигмой при изучении генетической организации других организмов.

В природе линии, гомозиготные по двум рецессивным мутациям, почти не встречаются: генетики вынуждены специально конструировать их для постановки анализирующих скрещиваний. Используемый для этого метод схематически изображен на рис. 5.2: дигомозиготные особи возникают в результате рекомби-

Рис. 5.2. Генотипы потомства в поколении F₂ полученном от скрещивания двух линий, каждая из которых гомозиготна по одному рецессивному гену. Гомозигота по двум рецессивным аллелям представлена в правом нижнем углу.

нации в поколении F₂ от скрещивания особей, гомозиготных по разным рецес-

сивным мутациям

Рекомбинация сцепленных генов

Объединение множества генов в одной хромосоме определяет характер наследования признаков, контролируемых этими генами. Гены, находящиеся в одной хромосоме, часто не расходятся независимо и потому представляют собой второе исключение из законов Менделя (первым было рассмотренное нами ранее наследование, сцепленное с полом). Гены, характер наследования которых отличается от независимого расщепления, называются сцепленными.

Во второй главе мы видели, что Мендель постулировал два возможных исхода скрещивания двух чистых линий гороха, одна из которых имеет гладкие желтые семена (RR Y Y), a другая - морщинистые и зеленые (rrуу). Если при формировании гамет в поколении F₁ распределение аллелей независимо, то следует ожидать возникновения в равных долях четырех типов гамет (RY,Ry,rY и ry), что ведет к появлению в поколении четырех фенотипов в отношении 9:3:3:1. Если же аллели каждого родителя оставались при формировании гамет в поколении f₁ вместе, то возникли бы лишь два типа гамет: RY и rу. Другими словами, гены, определяющие форму семян и их цвет, были бы полностью сцеплены. Результат такого полного сцепления проявлялся бы в поколении F₂. Оно было бы представлено лишь растениями двух типов с гладкими желтыми семенами и с морщинистыми зелеными в отношении 3:1. Если бы эти гены были полностью сцеплены, то каждая пара признаков (гладкие и желтые, а также морщинистые и зеленые) наследовалась бы как один признак.

Рис. 5.3. Генотипы потомства от анализирующего скрещивания по двум генетическим локусам. Выписанные справа числа означают долю (в %) соответствующего генотипа в потомстве, если 1) локусы а и b расходятся в мейозе независимо и 2) если они полностью сцеплены.

Генетики предпочитают изучать сцепление посредством анализирующего скрещивания, т. е. скрещивания с родительской линией, гомозиготной по рецессивным генам (рис. 5.2). При анализирующем скрещивании фенотип потомства прямо отражает типы гамет, формируемые гетерозиготным родителем, как это показано для случаев независимого расщепления и полного сцепления на рис. 5.3. В первом из представленных на рис. 5.3 случаев при независимом расщеплении аллелей двух генов следует ожидать, что в равном отношении образуются четыре генотипа. Два из них содержат те же сочетания аллелей, что и у родителей (а ⁺ b ⁺и ab), a два - новые рекомбинантные сочетания аллелей (а ⁺ b и ab ⁺ ). Если в потомстве родительские типы и рекомбинантные типы представлены в равном отношении, то, значит, гены α и b в мейозе гетерозиготного родителя расходятся независимо и могут быть названы несцепленными. Частота рекомбинации между двумя генами определяется как доля обоих рекомбинантных типов в потомстве (в примере, представленном на рис. 5.3, 50/100 = 0,5, или 50%). Если гены находятся в независимо расходящихся разных хромосомах, то частота рекомбинации равна 50%. Обратное, как мы вскоре увидим, вообще говоря, не всегда справедливо.

Во втором из представленных на рис. 5.3 случаев абсолютная связь между двумя генами ведет к тому, что в потомстве от анализирующего скрещивания следует ожидать появления лишь двух генотипов. Такое полное сцепление может служить веским, хотя и не исчерпывающим свидетельством в пользу того, что оба гена расположены в одной хромосоме.

На рис. 5.3 приведен пример анализирующего скрещивания, выявляющего полное сцепление двух рецессивных аутосомных признаков дрозофилы: черный цвет тела (b) и пурпурные глаза (рr). Если самец гетерозиготен по обоим генам, то комбинации аллелей в спермиях тождественны их комбинации в родительском генотипе, в результате чего в потомстве у половины мух тело черное и глаза пурпурные, а вторая половина потомства принадлежит дикому типу. Рекомбинантных сочетаний родительских аллелей не наблюдается: ни черных мух с нормальными глазами, ни мух с нормальным цветом тела и пурпурными глазами в потомстве нет. Представленные на рис. 5.4 данные указывают на полное сцепление генов, изучавшихся в этом скрещивании, из чего следует, что оба гена расположены в одной и той же хромосоме.

Рис. 5.4. Полное сцепление, наблюдаемое в анализирующем скрещивании у дрозофилы, когда самец гетерозиготен по обоим локусам.

Полного сцепления между аллелями двух различных генов обычно не наблюдается. Действительно, если признаки «черное тело и пурпурные глаза» всегда полностью сцеплены, т. е. всегда в мейозе расщепляются вместе, то мы вправе предположить, что оба признака являются проявлениями одного мутантного гена. Причину, по которой эти два гена ведут себя при скрещивании, представленном на рис. 5.4, как полностью сцепленные, мы обсудим после того, как рассмотрим результаты аналогичного скрещивания, в котором самка гетерозиготна по обоим генам.

В этом случае, как показано на рис. 5.5, в потомстве представлены четыре типа: два родительских (черное тело, пурпурные глаза и дикий тип) и два рекомбинантных (черное тело, нормальные глаза и нормальное тело, пурпурные глаза). Это те четыре типа, которых следует ожидать, если анализируемые гены расходятся независимо. Однако мух рекомбинантных типов много меньше, чем мух, имеющих родительский генотип (30/450), тогда как при независимом расхождении их число должно было бы быть примерно одинаковым (240/240). Такое отклонение от ожидаемого при независимом расщеплении свидетельствует о наличии сцепления. Генетики оценивают степень сцепления в таком скрещивании частотой рекомбинантных типов в потомстве: частота рекомбинаций в этом случае равна 30/480 = 0,0625, или 6,25%. Частота рекомбинаций для несцепленных генов равна 50% (240/480 = 0,50).

Рис. 5.5. Частичное сцепление, наблюдаемое при анализирующем скрещивании у дрозофилы, когда гетерозиготна по обоим локусам самка.

Рекомбинантные типы при таком скрещивании (рис. 5.5) возникают из рекомбинантных гамет, образующихся у самки в процессе кроссинговера при мейозе. Кроссинговер обычно происходит в мейозе всех организмов, и у самцов, и у самок, и во всех парах гомологичных хромосом. Однако у самцов многих видов насекомых отряда Diptera, в том числе и у дрозофил, Кроссинговер не происходит и рекомбинантные гаметы не возникают. Вот почему в скрещивании, представленном на рис. 5.4, аллели генов, находящихся в одной хромосоме, расходятся всегда вместе, т.е. ведут себя так, как этого следует ожидать при полном сцеплении.

Рис. 5.6 знакомит нас с примером наследования двух сцепленных генов Drosophila melanogaster, находящихся в Х-хромосоме. Все мужское потомство получает свою единственную Х-хромосому от матери, и эта Х-хромосома может быть как родительского, так и рекомбинантного типа. В этом примере анализирующее скрещивание гетерозиготной по обоим генам самки с самцом-носителем рецессивных аллелей обоих генов не обязательно, поскольку частоту рекомбинации можно определить по фенотипам гемизиготного мужского потомства. В Y-хромосоме нет аллелей соответствующих генов, расположенных в Х-хромосоме. В этом скрещивании двумя маркерами служили ген желтой окраски тела (у) и ген белоглазия (w); соответствующие доминантные аллели дикого типа определяют коричневатый цвет тела (у ⁺ ) и красные глаза (w⁺). Частота рекомбинации между этими генами, наблюдавшаяся при таком скрещивании, составляла 4/3 90 x 0,0 10.

Рис. 5.6. Генотипы потомства в поколении F₂ от скрещивания между самцами дрозофил с желтым телом (yellow) и самками с белыми глазами (white). Гемизиготность мужского потомства по Х-хромосоме позволяет определять генотипы самцов по их фенотипам, так же как в случае аутосом при анализирующем скрещивании. У самок в F₂ генотипы нельзя определить по фенотипам.

Анализ частоты рекомбинаций может дать ответы на два вопроса. Первый вопрос состоит в том, принадлежат ли оба гена одной хромосоме. Если наблюдаемая частота рекомбинаций между аллелями какихлибо двух генов меньше 50%, то на этот вопрос можно ответить положительно. Для генов, расположенных в одной хромосоме очень близко друг к другу, наблюдается обычно очень низкая частота рекомбинаций. По мере увеличения расстояния между генами частота рекомбинаций также увеличивается. Более того, кроссинговер между генами, находящимися в одной хромосоме, но сильно удаленными друг от друга, может происходить настолько часто, что наблюдаемая частота рекомбинаций будет близка к 50%, т.е. к значению, соответствующему независимому расщеплению. В таких случаях для определения принадлежности генов одной хромосоме требуется статистический анализ. Иногда хромосомы бывают настолько длинными, что гены, расположенные на разных концах, всегда расходятся независимо. Такие случаи можно выявить, лишь ответив на второй вопрос: каково взаимное расположение сцепленных генов в хромосоме? Рекомбинационный анализ дает ответ и на этот вопрос.

Генетические карты

Впервые порядок генов в хромосоме удалось установить Альфреду Стертеванту при выполнении им дипломной работы в «мушиной» лаборатории Томаса Ханта Моргана. В 1911 г. Морган и его студенты обнаружили существование множества сцепленных с полом мутаций у дрозофилы. Сцепленность с полом не оставляла сомнений в том, что соответствующие гены локализованы в Х-хромосоме. При проведении скрещиваний между линиями, содержащими различные мутации (см., например, рис. 5.6), Обнаружилось, что частоты рекомбинации между различными парами генов зависят от того, какая именно пара генов изучается, и почти постоянны для каждой пары. Частоты рекомбинаций, наблюдавшиеся между отдельными парами генов, представлены в табл. 5.1. Стертевант первым понял, что эти данные можно использовать для построения физической модели, или карты Х-хромосомы, на которой указывалось бы относительное расположение различных генов. Говоря более точно, Стертевант доказал на основании этих данных, что карта должна быть линейной, или одномерной, т. е. иметь форму, в точности совпадающую с нитевидной формой хромосом, наблюдаемой под микроскопом. Первая генетическая карта Х-хромосомы, построенная Стертевантом на основании данных, представленных в табл. 5.1, изображена на рис. 5.7.

Стертевант рассудил, что если гены расположены вдоль хромосомы, то чем дальше они расположены друг от друга, тем больше вероятность того, что кроссинговер произойдет между ними. Следовательно, частота рекомбинаций между удаленными генами должна быть больше, чем между соседними генами.

Проанализируем на основе этих соображений данные табл. 5.1. Частота рекомбинаций между мутациями yellow и white составляет 0,010, и, следовательно, они должны быть расположены много ближе друг к другу, чем yellow и vermilion, частота рекомбинаций между которыми составляет 0,322. Частота рекомбинаций между white и vermilion равна 0,300, следовательно, white должен быть ближе к vermilion, чем yellow. Аналогичное рассуждение показывает, что vermilion расположен рядом с miniature (частота рекомбинации 0,030) и что vermilion находится ближе к white, чем miniature (частоты рекомбинаций 0,300 и 0,327 соответственно). Следовательно, vermilion должен располагаться между white и miniature. Наконец, rudimentary почти не сцеплен с white, так как частота рекомбинаций между ними равна 0,45, т.е. близка к значению 0,50, отвечающему независимому расщеплению. Из того, что vermilion более тесно, чем rudimentary, сцеплен с white, следует, что он расположен между ними, и, значит, rudimentary лежит справа от white.

Таблица 5.1. Частота рекомбинации (между некоторыми сцепленными с полом мутациями Drosophila melanogaster
Гены	Частота рекомбинации
Yellow (у) — white (w) Yellow (у) -vermilion (ν) Yellow (y) -miniature (m) Vermilion -miniature (m) White (w) -vermilion (v) White (w) -miniature (m) White (w) -rudimentary (r) Vermilion (v) -rudimentary (r)	0,010 0,322 0,355 0,030 0,300 0,327 0,450 0,269
По Sturtevant A.H. (1913). J. Exp. Zool., 14, 43.

Рис. 5.7. Первая генетическая карта Х-хромосомы D. melanogaster; на ней указано взаимное расположение генов yellow, white, vermilion, miniature и rudimentary. Ген yellow произвольно выбран точкой отсчета на генетической карте.

Взаимное расположение white и rudimentary показывает, что, как уже отмечалось ранее, два гена могут принадлежать одной хромосоме и тем не менее наследоваться независимо - для этого они лишь должны быть расположены достаточно далеко друг от друга. Например, ген, находящийся на некотором расстоянии справа от rudimentary, будет практически не сцеплен с white (т.е. частота рекомбинаций между ними будет неотличимой от 0,50), и тем не менее можно показать, что он принадлежит к той же хромосоме, что и white, поскольку оба они сцеплены с rudimentary. На рис. 5.7 расстояния между генами соответствуют частотам рекомбинации между ними. Частота рекомбинации, равная 1%, определяет единицу масштаба на генетической карте и называется морганидой или сантиморганидой (в честь Т. X. Моргана). Положение каждого гена на карте определяется его расстоянием от ближайшего из группы сцепленных генов. Произвольно принято, что ген yellow расположен на левом конце карты, т. е.находится в положении 0,0, и положение всех других генов оценивается по сумме частот рекомбинаций между ближайшими соседями. В результате получается, что расстояние между yellow и rudimentary на карте Х-хромосомы составляет 0,58 сМ.

Трехфакторные скрещивания

В тот день, когда «этот мальчишка Стертевант» (слова Германа Мёллера, в ту пору аспиранта в лаборатории Моргана) представил свое доказательство линейной упорядоченности генетической карты, в лаборатории Моргана царило необычайное возбуждение. Доказательство основывалось на анализе данных по скрещиваниям, в которых расщепление происходило по трем различным локализованным в Х-хромосоме генам (трехфакторное скрещивание).

Перечислим все типы яйцеклеток самки, гетерозиготной по мутациям желтое тело (yellow), белые глаза (white) и миниатюрные крылья (miniature), т. е. самки с генотипом ywm/ + + + .

Рис. 5.8. Результаты анализирующего скрещивания у D. melanogaster по трем локусам Х-хромосомы.

Кроме двух родительских комбинаций аллелей возможно еще шесть, поскольку в Х-хромосоме может оказаться любой из двух аллелей каждого гена. Следовательно, общее число возможных комбинаций равно 2·2·2 = 8 (рис. 5.8). Поскольку эти гены сцеплены, различные сочетания аллелей возникают с разными частотами, определяемыми комбинацией аллелей в родительских хромосомах и частотой кроссинговеров между каждой парой генов. Эти частоты рекомбинаций приведены на рис. 5.8. Если гены линейно упорядочены вдоль хромосомы, то возможны, как это изображено на рис. 5.9, три различные последовательности их расположения. Одна пара реципрокных рекомбинантных типов из числа представленных на рис. 5.8, не может возникнуть из исходной последовательности посредством одного кроссинговера в мейозе ; для ее образования необходимы два кроссинговера в одном мейозе. Другими словами, если три гена линейно упорядочены, то не все возможные рекомбинантные типы могут возникать независимо друг от друга. Как мы уже видели, единичные кроссинговеры происходят между сцепленными генами с частотой, меньшей 1/2. Следовательно, частота рекомбинантных типов, возникающих в результате двух кроссинговеров, должна представлять собой произведение дробей, т.е. быть меньше частоты появления рекомбинантных типов, возникающих в результате одного кроссинговера. Лишь одна из трех возможных последовательностей генов, изображенных на рис. 5.9, согласуется с данными, приведенными на рис. 5.8, а именно y-w-m. Наблюдаемая частота рекомбинаций между у и w равна 0,007, а между w и m -0,330. Следовательно, частота возникновения рекомбинантного класса в результате двойного кроссинговера должна примерно составлять 0,007·0,330 = 0,00231. Самый редкий класс рекомбинантов из числа изображенных на рис. 5.8 - это тот, который появляется в результате кроссинговера между w и у - т (частота 9/10495 = = 0,00086); следовательно, именно этот класс -продукт двойного кроссинговера. Стертевант показал, что такой тип отношений характерен для любых трех генов в Х-хромосоме и что только линейная генетическая карта может соответствовать данным по частоте рекомбинаций во множестве различных скрещиваний, затрагивающих различные тройки генов. Его открытие линейной упорядоченности расположения генов в хромосоме по своему общему значению непосредственно следует за открытием генов Менделем. Линейная модель хромосомы послужила основой для всех последующих работ в генетике и предвосхитила открытие линейной природы молекулы ДНК.

Рис. 5.9. Хроматиды до и после рекомбинаций, предшествующих первому мейотическому делению, у гетерозиготных по трем локусам матерей. Представлены три гипотетически возможных взаимных расположения локусов yellow, white и miniature. С данными, представленными на рис. 5.8, согласуется лишь первая последовательность локусов.

Таким образом, трехфакторные скрещивания позволяют установить порядок расположения трех генов в хромосоме и определить частоты рекомбинаций между ними. Такой способ анализа, впервые разработанный Стертевантом, послужил основой для построения всех генетических карт. Генетическая карта генома Drosophila melanogaster, построенная Стертевантом и другими сотрудниками лаборатории Моргана, изображена на рис. 5.10.

Генетическая интерференция

Когда гены расположены не очень далеко друг от друга, частоту рекомбинации можно рассматривать как вероятность того, что рекомбинация произойдет между ними. Такая оценка позволяет определить, независимо ли друг от друга происходят кроссинговеры в одной хромосоме. Если два акта рекомбинации происходят независимо, то частота двойной рекомбинации должна быть произведением частот двух соответствующих одинарных рекомбинаций. Из данных, представленных на рис. 5.8, следует, что ожидаемая частота двойного кроссинговера составляет 0,330-0,007 = 0,00231. Наблюдаемая частота двойного кроссинговера, однако, равна лишь 9/10495 = 0,00086, т.е. значительно меньше ожидаемой.

Отношение наблюдаемой частоты двойных рекомбинантов к ожидаемой называется коэффициентом коинциденции (совпадения) (с). Акт рекомбинации между у и т делает менее вероятной рекомбинацию вблизи этого участка. Это явление носит название интерференции I. Мерой интерференции служит разность I = 1 — с. В рассмотренном примере I = 1 - 0,00086/0,00231 = 1 - 0,374 = 0,626.

Наблюдаемое значение I сильно зависит от того, какие именно локусы изучаются в данном скрещивании. Если локусы расположены далеко друг от друга и разделены центромерой, I может быть равно нулю. Для близких локусов I ≃ 1, и поэтому при построении генетических карт используется частота рекомбинации между близко расположенными маркерами.

Когда происходит кроссинговер?

Кроссинговер происходит на четырехцепочечной, или тетрадной, стадии мейоза, когда каждая хромосома состоит из двух сестринских хроматид (см. гл. 1). В этом можно убедиться, анализируя генотипы женского потомства самок дрозофил, несущих сцепленные Х-хромосомы и гетерозиготных по мутации, локализованной в этой хромосоме.

Нормальная Х-хромосома дрозофилы-телоцентрик, т.е. центромера расположена на конце хромосомы. При сцеплении Х-хромосом (X · X) две Х-хромосомы соединены одной центромерой и таким образом образуют метацентрическую хромосому, у которой каждое плечо фактически представляет собой полноценную Х-хромосому (см. гл. 3). В хромосомном наборе самок со сцепленными Х-хромосомами присутствует обычно еще и Y-хромосома (X · X/Y). Наличие Y-хромосомы у таких самок не оказывает влияния на их физиологию, поскольку пол определяется количеством Х-хромосом в наборе. Y-хромосома необходима лишь для обеспечения плодовитости самцов. У самок со сцепленными Х-хромосомами происходит необычное расщепление сцепленных с полом генов (см. рис. 3.9). Лишь половина зигот таких самок развивается нормально, давая женское потомство (со сцепленными материнскими Х-хромосомами и отцовской Y-хромосомой) и мужское потомство с отцовской Х-хромосомой и материнской Y-хромосомой.

Некоторая часть женского потомства самок со сцепленными Х-хромосомами, в которой оба гомолога гетерозиготны по рецессивным мутациям, оказывается гомозиготной по одной или нескольким рецессивным мутациям. Частота, с которой данная мутация переходит в сцепленных Х-хромосомах в гомозиготное состояние, возрастает с увеличением расстояния от соответствующего локуса до центромеры. Следовательно, возникновение таких новых генотипов по сцепленным Х-хромосомам происходит в результате кроссинговера. Их появление возможно только в том случае, если кроссинговер происходит на тетрадной стадни мейоза, как это изображено на рис. 5.11. Рекомбинация на любой другой стадии, предшествующей тетрадной, т.е. до дупликации хромосом, не приводила бы к такому результату.

Рис. 5.11. Для того чтобы в мейозе из гетерозиготной сцепленной Х-хромосомы могла образоваться гомозиготная сцепленная Х-хромосома, необходимо, чтобы кроссинговер происходил на стадии четырех хроматид. Кроссинговер должен происходить между центромерой и мутантным локусом.

Мейоз у грибов

Рис. 5.12. Жизненный цикл Neurospora; показан механизм линейного упорядочения аскоспор, являющихся продуктами мейотического деления ядер в аске. Во втором мейотическом делении нити веретена не перекрываются, и ядра каждой половины аска сохраняют центромеры, разошедшиеся в первом мейотическом делении. Соответственно, нити последующего митотического деления также не перекрываются, так что ядра каждой четверти аска содержат сестринские митотические хроматиды с центромерами, разошедшимися во втором мейотическом делении. Таким образом, аскоспоры в аске оказываются упорядоченными в отношении центромер, расходившихся в первом и втором мейотических делениях.

У некоторых организмов, например у грибов, можно идентифицировать продукты тетрады и определить их генотипы. У хлебной плесени Neurospora crassa мейоз происходит сразу после слияния ядер различных половых типов в клетке, называемой аском (пол или половой тип у плесени определяется аллелем одного гена). В результате двух последовательных мейотических делений и одного митоза в аске образуется восемь спор. Веретено первого деления не перекрывает веретено второго деления, так что последовательность спор в аске отражает последовательность расхождения центромер в первом и втором мейотических делениях (рис. 5.12). Такое упорядоченное расположение спор дает возможность выявить кроссинговеры, происходящие как между центромерой и мутантными генами, так и между самими мутантными генами (рис. 5.13). В отсутствие кроссинговера аллели расходятся в первом мейотическом делении и попадают в споры, расположенные в противоположных концах аска. Если происходит один кроссинговер между центромерой и различными аллелями одного гена, то аллели расщепляются во втором мейотическом делении, и в результате на противоположных концах аска оказываются споры с двумя родительскими генотипами. Если единственный кроссинговер происходит между двумя генами, то половина спор в аске относится к родительским типам, а половина - к рекомбинантным. Доля асков, содержащих продукты расщепления во втором делении, служит мерой генетического расстояния между центромерой и исследуемым локусом. Однако поскольку лишь половина хроматид в тетраде рекомбинанта, то расстояние между геном и центромерой равно лишь половине частоты асков с продуктами расщепления во втором делении. Упорядоченное расположение спор у хлебной плесени позволяет, таким образом, определить положение центромеры по отношению к мутантным аллелям генов соответствующей хромосомы.

Рис. 5.13. Наблюдение за первым и вторым расхождением аллелей в мейозе по положению каждого генотипа в аске. Аскоспоры гаплоидны, и по их фенотипу можно однозначно судить о их генотипе. Кроссинговер между центромерой и Аа приводит во втором делении к попарной сегрегации маркеров. Кроссинговер между Аа и ВЬ приводит в первом делении к расхождению проксимальных маркеров (Аа), а во втором делении -к расхождению дистальных маркеров (ВЬ). В последнем случае в зависимости от того, как располагаются рекомбинантные хромосомы в первом делении, возможны четыре различные последовательности спор в аске; на рисунке представлены две из них.

Рис. 5.14. По последовательности спор в аске можно выделить четыре типа двойных кроссоверов.

На рис. 5.14 изображены четыре типа событий, наблюдаемых в тетрадах хлебной плесени при двойном кроссинговере. Существование асков с таким расположением спор, которое возможно лишь в результате кроссинговеров, затрагивающих одновременно три и четыре хроматиды, доказывает, что кроссинговер происходит именно на стадии тетрады, а не на двунитчатой стадии, предшествующей репликации ДНК хромосом. Кроме того, эти данные демонстрируют еще одно важное положение, а именно то, что происходящая в мейозе рекомбинация приводит одновременно к возникновению реципрокных рекомбинантных типов.

Цитологические наблюдения кроссинговера

До сих пор мы могли основываться лишь на косвенных данных, полагая, что в основе рекомбинации лежит кроссинговер, т. е. физический обмен реципрокными участками хромосом между двумя разорванными хроматидами. Прямые доказательства были впервые получены в 1931 г. Харриетом Крейтоном и Барбарой Мак-Клинток при исследовании кукурузы и Куртом Штерном на дрозофиле. В обоих случаях данные по генетической рекомбинации совпадали с цитологически наблюдаемым физическим обменом участками хромосом. Результаты, полученные на кукурузе, состояли в следующем. Скрещивали растения кукурузы, гетерозиготные по двум генетическим маркерам, а именно аллелю бесцветности (с) при окрашенном диком типе (с ⁺ ) и аллелю восковистости (wx) при крахмалистом диком типе (wx ⁺ ), и двум цитологическим маркерам, а именно гетерохроматиновому вздутию и транслокации (рис. 5.15). В потомстве одного из таких скрещиваний было получено 28 зерен четырех различных фенотипов, представленных на рисунке. Зерна были пророщены, и хромосомы каждого растения исследовали на предмет наличия или отсутствия вздутия и транслоцированного участка. Растения wx ⁺ /wx ⁺ можно было отличить от wx ⁺ /wx, поскольку в первом случае все пыльцевые зерна были крахмалистыми, тогда как во втором случае - лишь половина. Обнаруженная взаимосвязь между кроссинговером и цитологическими перестройками свидетельствует о том, что генетический обмен аллелями сопровождается физическим обменом участками хромосом.

Рис. 5.15. Взаимосвязь между генетическим обменом и перестройками хромосом; с и wx - генетические маркеры, вздутие (изображено кружком) и транслоцированный участок (волнистая линия) - цитологические маркеры. Генотипы, помещенные в окрашенные прямоугольники, демонстрируют связь между генетической и цитологической рекомбинациями. Обратите внимание на то, что изображенное скрещивание не является анализирующим и что не все генотипы могут быть однозначно идентифицированы.

Корреляция между генетическими и цитологическими картами хромосом дрозофилы

Большая часть хромосом эукариот, в том числе и хромосомы дрозофил, характеризуется чередованием генетически активных, или эухроматиновых, участков и генетически неактивных участков, называемых гетерохроматиновыми (см. дополнение 1.1). Большинство известных генов дрозофилы расположены в эухроматиновых участках. В соматических клетках некоторых тканей дрозофилы и других видов двукрылых, в особенности в клетках слюнных желез их личинок, содержатся так называемые гигантские хромосомы. Они образуются в результате множества последовательных удвоений хромосом, не сопровождающихся ядерными делениями. В зависимости от вида и стадии развития в каждом ядре каждая хромосомная нить может быть представлена более чем в 1000 копиях, и все нити обоих гомологов располагаются по всей длине в точности друг против друга, образуя политенные интерфазные хромосомы, представляющие собой подобия многожильного троса. Схематическая модель политенной Х-хромосомы изображена на рис. 5.16, а электронная микрофотография ядра клетки слюнных желез дрозофилы - на рис. 5.17. Различия в содержании белка и в степени спирализации интерфазных хромосом обусловливают их поперечную исчерченность, хорошо заметную на рис. 5.18.

Рис. 5.16. Схематическое изображение вероятной структуры политенной Х-хромосомы из клетки слюнных желез дрозофилы. Последовательные репликации эухроматиновых участков хромосомы доводят число копий примерно до тысячи. А. Различия в спирализации по-разному амплифицированных участков гомологичных хромосомных нитей приводят к появлению визуально наблюдаемой поперечной исчерченности (B) хромосом. Б. Гены рибосомной РНК (рРНК) локализованы в гетерохроматине Х-хромосомы и также частично амплифицированы, однако по неизвестным причинам это не проявляется в виде дискретных линий.

Рис. 5.17. Сделанная на сканирующем электронном микроскопе фотография интактного ядра клетки слюнных желез дрозофилы после удаления ядерной мембраны. Хорошо видна исчерченность. Крупное сферическое образование в середине — это ядрышко. (Dr. John W. Sedat, University of California, San Francisco.)

Рис. 5.18. Окрашенный препарат политенных хромосом клеток слюнных желез дрозофилы. Фотография сделана с помощью обычного светового микроскопа. (Lefevre G. (1976). In: The Genetics and Biology of Drosophila, vol. la, ed. by M. Ashburner and E. Novitski; Academic Press, New York.)

Рис. 5.19. Схема участка политенной Х-хромосомы дрозофилы. Указана цитологическая локализация некоторых обсуждающихся в тексте делеций и дупликаций. [Kiger J. Α., Jr., Golanty E. (1977). Genetics. 85, 609.]

У дрозофил известны многочисленные хромосомные аберрации, при которых отдельные участки хромосом утрачиваются (делеции Df) или удваиваются (дупликации, Dp, см. гл. 21). На цитологических препаратах политенных хромосом с делециями или дупликациями концевые точки этих аберраций обычно можно определить очень точно. На рис. 5.19 изображены границы некоторых известных делеции и дупликаций в Х-хромосоме дрозофилы. Потери генетической информации, связанные с делециями, фенотипически проявляются у гетерозигот по рецессивным мутациям. Например, у гетерозигот Df(l)N⁸/w, Df(l )N^St/w и Df(l)N ^--^67k30/w глаза белые, что указывает на то, что в хромосомах с этими тремя нехватками ген w ⁺ отсутствует, и, следовательно, этот ген расположен в участке, общем для всех трех делеций, т. е. в полосах ЗС2-ЗС6. У гетерозиготы Df(l)N ⁶⁴^·16/w глаза красные, таким образом, ген w ⁺ в этой хромосоме присутствует. Следовательно, ген w ⁺ должен быть расположен между левыми концами делеций Df(1)N⁶⁴ⁱ¹⁶ и Df(l)N^St или Df(l)w^--^67k30, т.е. должен находиться в полосе 3С2. Заметим, что полоса 3С2 находится внутри всех трех дупликаций, представленных на рис. 5.19. Эти участки могут быть транслоцированы во вторую аутосому, в третью аутосому и в Y-хромосому соответственно, и во всех трех случаях можно установить присутствие гена w ⁺ в геноме, что подтверждает локализацию w ⁺ в полосе 3С2. Например, самцы с генотипом w/Dp(1; Y)w⁺ обладают красными глазами, отсюда следует, что ген w⁺ содержится в участке Х-хромосомы, транслоцированном на Y-хромосому. Такие цитологические сопоставления были проведены для многих генов, локализованных в различных хромосомах дрозофилы, и они убедительно продемонстрировали, что генетическая карта каждой хромосомы, полученная на основе данных по рекомбинации, хорошо соответствует реальной физической структуре хромосом (рис. 5.20). Неполное количественное совпадение между расстояниями на генетической карте и реальными расстояниями в политенной хромосоме может быть следствием неравномерного растяжения различных участков хромосомы в процессе приготовления хромосомных препаратов. Возможно, однако, что некоторые участки Х-хромосомы участвуют в генетической рекомбинации чаще других и вследствие этого на генетической карте занимают больше места, чем на физической.

Рис. 5.20. Генетическая карта некоторых мутаций, известных в Х-хромосоме D. melanogaster. Указаны связи генетической карты с цитологической структурой политенных хромосом слюнных желез. (Handbook of Genetics, 1975, vol. 3, ed by R.C. King, Plenum Press, New York.)

Внеядерная наследственность

Принципы генетического анализа применялись при исследовании многих эукариотических организмов: высших животных и растений, а также более просто устроенных эукариот, таких как грибы, водоросли и простейшие. Составлены подробные хромосомные карты множества различных видов, представляющих научный или практический интерес. Эти карты детально описывают организацию генов в ядрах клеток. Однако не все эукариотические гены локализованы в хромосомах клеточных ядер. Вскоре после переоткрытия менделевских законов наследования стало ясно, что некоторые типы изменчивости не подчиняются этим законам. В 1909 г. Карл Корренс опубликовал работу по наследованию пестролистности у Mirabilis jalapa, в которой был описан неменделевский тип наследования.

Для многих видов декоративных растений характерна пестролистность - появление белых или желтых пятен и полос на листьях зеленых растений (рис. 5.21). Желтые участки могут быть небольших размеров, однако иногда желтыми становятся целые побеги, тогда как другие остаются зелеными или пестрыми. Корренс брал пыльцу с цветков, растущих на желтых, пестрых и зеленых побегах, и наносил ее (предварительно удалив тычинки) на пестики цветов, растущих на побегах всех трех типов. Оказалось, что свойства проросших из таких семян растений определяются исключительно характером материнского цветка и не зависят от свойств цветка, с которого была взята пыльца (табл. 5.2). Эти результаты были первым примером внеядерной, или цитоплазматической, наследственности.

Рис. 5.21. Пестролистность у распространенного декоративного растения.

Таблица 5.2. Потомство от скрещивания растений Mirabilis jalapa с различны- ми типами цветков¹
Отцовское растение	Материнское растение	Потомство
	Желтое	Желтое
Желтое	Пестролистное	Желтое, пестролистное
		и зеленое
	Зеленое	Зеленое
	Желтое	Желтое
Пестролистное	Пестролистное	Желтое, пестролистное
		и зеленое
	Зеленое	Зеленое
	Желтое	Желтое
Зеленое<

Ф. Айала, Дж. Кайгер

Современная генетика

Том 1

Одноклеточные и многоклеточные эукариоты

Мейоз I

Мейоз II

2.Менделевская генетика

Первые представления о наследственности

3. Хромосомные основы наследственности

Сцепленное с полом наследование у человека и других видов

Y-хромосома

4. Природа генетического материала

Бактерии как экспериментальный объект

Экспериментальные исследования бактериофагов

ДНК - трансформирующий фактор пневмококка

Нуклеиновые кислоты - наследственный материал вирусов

Химический состав и строение нуклеиновых кислот

Различные формы организации двухцепочечной ДНК

5. Геном эукариот

Цитологические наблюдения кроссинговера

Корреляция между генетическими и цитологическими картами хромосом дрозофилы